血小板におけるRhoA-フォルミンを介した新規脂質シグナル調節機構の解明

血栓形成において血小板の粘着・顆粒からの内容物分泌・血小板凝集は不可欠なプロセスである。トロンビン、ADP、トロンボキサンA2(TXA2)等のアゴニスト受容体からの複数のシグナル伝達経路はGα13を介してRhoAを活性化する。その結果①血小板の形態変化②濃染顆粒内容物の分泌をおこす。血小板は止血血栓にとどまらず，動脈硬化・血管新生・炎症・アレルギー・がん転移等を含む種々の病態に関与している。この多機能性は血小板が数多くの生理活性物質を貯蔵・産生し，活性化に伴って細胞外へ放出することと関連している。血小板細胞膜から遊離したアラキドン酸は、プロスタグランジン(PG)、ロイコトリエン(LT)等の生理活性物質に代謝される。PG、TXA2を生成するシクロオキシゲナーゼ(COX)とともに、血小板にはアラキドン酸を基質とするもう１つの酵素、リポキシゲナーゼ(LOX)が存在する。LOXには酸素付加部位の違いによって5-LOX、12-LOX、15-LOXが知られている。本研究ではRhoA-フォルミンが12-LOXの細胞膜への局在を介して血小板凝集に関与する可能性につき検討する。我々はRho GTPaseをbaitとしたアフィニティクロマトグラフィーとそれに続くマススペクトロメトリー（LC/MS-MS）実験系を確立した。血小板細胞質分画をアフィニティーカラム精製することで、既知のエフェクター (mDia, PKN1, Rho kinase, IQGAP2, Daam1, Daam2)に加えて、アラキドン酸リポキシゲナーゼ(ALOX)が活性型RhoAに結合することが見いだされた。今年度は巨核球細胞株MEG-O1に活性型と不活性型RhoAを発現し、培養上清中の12-HETEを測定する実験系を確立し、RhoA活性の12-LOX機能への影響を調査中である。

血栓形成において血小板の粘着・顆粒からの内容物分泌・血小板凝集は不可欠なプロセスである。トロンビン、ADP、トロンボキサンA2(TXA2)等のアゴニスト受容体からの複数のシグナル伝達経路はGα13を介してRhoAを活性化する。その結果①血小板の形態変化②濃染顆粒内容物の分泌をおこす。血小板は止血血栓にとどまらず，動脈硬化・血管新生・炎症・アレルギー・がん転移等を含む種々の病態に関与している。この多機能性は血小板が数多くの生理活性物質を貯蔵・産生し，活性化に伴って細胞外へ放出することと関連している。血小板細胞膜から遊離したアラキドン酸は、プロスタグランジン(PG)、ロイコトリエン(LT)等の生理活性物質に代謝される。PG、TXA2を生成するシクロオキシゲナーゼ(COX)とともに、血小板にはアラキドン酸を基質とするもう１つの酵素、リポキシゲナーゼ(LOX)が存在する。LOXには酸素付加部位の違いによって5-LOX、12-LOX、15-LOXが知られている。本研究ではRhoA-フォルミンが12-LOXの細胞膜への局在を介して血小板凝集に関与する可能性につき検討する。我々はRho GTPaseをbaitとしたアフィニティクロマトグラフィーとそれに続くマススペクトロメトリー（LC/MS-MS）実験系を確立した。血小板細胞質分画をアフィニティーカラム精製することで、既知のエフェクター (mDia, PKN1, Rho kinase, IQGAP2, Daam1, Daam2)に加えて、アラキドン酸リポキシゲナーゼ(ALOX)が活性型RhoAに結合することが見いだされた。今年度は巨核球細胞株MEG-O1に活性型と不活性型RhoAを発現し、培養上清中の12-HETEを測定する実験系を確立し、RhoA活性の12-LOX機能への影響を調査中である。