Induction of hypothalamic neurons by neuronal direct reporogramming

通过神经元直接重编程诱导下丘脑神经元

• 批准号: 22K08637
• 负责人: 亀山 俊樹
• 金额: $ 2.66万
• 依托单位: Fujita Health University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• 财政年份: 2022
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2022-04-01 至 2025-03-31
• 项目状态: 未结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-22K08637/
• 关键词: SFEBq法; 分散培養; オルガノイド; RNA-seq; ダイレクト・リプログラミング; 視床下部; 発生; ダイレクトリプログラミング; 転写制御因子

まず、SFEBq法による視床下部神経細胞分化の際の遺伝子発現変化をRT-qPCRで詳細に解析を行った。SFEBq法により培養14日目に視床下部神経前駆細胞が生じるが、その後は、細胞を分散処理して平面培養（2Ｄ培養）条件下、またはセルカルチャー・インサート上でオルガノイド様細胞塊のまま（3Ｄ培養）培養を継続し、視床下部神経を分化・成熟させる。この際、2Ｄ培養下と3D培養下デバソプレッシン（AVP）神経の分化効率に違いがあることに着目した。そこでAVP神経以外の神経細胞についても分化効率を比較したところ、３Ｄ培養の方が高効率で分化する細胞種、反対に２Ｄ培養下の方が高効率で分化する細胞種、および２D培養でも３Ｄ培養でも分化効率は変わらない細胞種があることが明らかとなった。このことから、2D培養と3D培養は、単純に神経分化効率に差があるばかりでなく、神経細胞の特異性を生み出す機構にも差異が生じていることが推測された。この差異を明らかにするため、培養14日目視床下部神経前駆細胞（PRE）、2D培養および３Ｄ培養でそれぞれ28日後の細胞からTotal RNAを生成しRNA-seqによりトランスクリプトーム解析を行った。その結果、Notchシグナル関連因子の他、AVP神経やオキシトシン（OXT）神経の細胞に関与することが知られているOtpやPou3f2等複数の遺伝子の発現が2D培養下と3Ｄ培養下で変化していることが明らかとなった。一方で、視床下部神経ダイレクト・リプログラミング法の開発のため、今年度はES細胞（EB5細胞株）を用いて、視床下部神経細胞分化に必要な遺伝子群の組合せの検討を行った。その結果、ある転写因子の組合せによりAVP神経、OXT神経の分化を誘導する事に成功した。

The gene expression during the differentiation of neurons in the lower part of the optic bed was analyzed in detail by RT-qPCR. SFEBq method: 14 days after culture, the cells in the lower part of the optic bed were differentiated and matured under the condition of plane culture (2D culture). In 2D culture and 3D culture, the differentiation rate of AVP was higher than that of the control group. The differentiation rate of neurons other than AVP was higher in 3D culture than in 2D culture. The difference between 2D culture and 3D culture in the rate of differentiation of neurons and the difference between 2D culture and 3D culture in the rate of differentiation of neurons is speculated. These differences were revealed in the following ways: 14-day-old culture of hypothalamus cells (PRE), 2D culture, and 3D culture. 28-day-old cells were cultured for Total RNA production and RNA-seq analysis. The results showed that the expression of Notch related factors, AVP, OXT and POU3f2 in 2D culture and 3D culture were significantly different. In this study, we investigated the combination of essential gene groups for the differentiation of ES cells (EB5 cell line) and hypooptic neurons. The combination of the results and the writing factors induced the differentiation of AVP and OXT.

项目成果

空間的培養条件検討による視床下部神経分化誘導因子の探索

通过检查空间培养条件寻找下丘脑神经元分化诱导因子

• 发表时间: 2022
• 作者: 鈴木つくし;塚本舜也;目良義也;久野萌花;河田美穂;小谷侑;斎藤加奈子;中島昭;亀山俊樹;長崎弘
• 通讯作者: 長崎弘

Molecular differences in the differentiation potential of hypothalamic neurons induced by different spatial culture conditions

不同空间培养条件诱导下丘脑神经元分化潜能的分子差异

• 发表时间: 2023
• 作者: 鈴木つくし;塚本舜也;目良義也;久野萌花;河田美穂;小谷侑;斎藤加奈子;中島昭;亀山俊樹;長崎弘
• 通讯作者: 長崎弘

Characterization of hypothalamic MCH neuron development in a 3D differentiation system of mouse embryonic stem cells

小鼠胚胎干细胞 3D 分化系统中下丘脑 MCH 神经元发育的表征

• DOI: 10.1523/eneuro.0442-21.2022
• 发表时间: 2022
• 期刊: eNeuro
• 影响因子: 3.4
• 作者: Yu Kodani;Kodani Y;Kawata M;Suga H;Kaneko YS;Nakashima A;Kameyama T;Saito K;Nagasaki H
• 通讯作者: Nagasaki H

マウスES細胞を用いた遺伝子導入による視床下部室傍核神経の直接分化誘導

使用小鼠 ES 细胞通过基因转移直接分化下丘脑室旁核神经元

• 发表时间: 2022
• 作者: 目良義也;塚本舜也;鈴木つくし;河田美穂;小谷侑;斉藤加奈子;中島昭;亀山俊樹;長崎弘
• 通讯作者: 長崎弘

転写制御因子群強制発現による視床下部神経細胞の分化誘導

通过转录调节因子的强制表达诱导下丘脑神经元分化

• 发表时间: 2022
• 作者: 亀山俊樹;目良義也;塚本舜也;鈴木つくし;河田美穂;小谷侑;斉藤加奈子;中島昭;長崎弘
• 通讯作者: 長崎弘