Induction of hypothalamic neurons by neuronal direct reporogramming

まず、SFEBq法による視床下部神経細胞分化の際の遺伝子発現変化をRT-qPCRで詳細に解析を行った。SFEBq法により培養14日目に視床下部神経前駆細胞が生じるが、その後は、細胞を分散処理して平面培養（2Ｄ培養）条件下、またはセルカルチャー・インサート上でオルガノイド様細胞塊のまま（3Ｄ培養）培養を継続し、視床下部神経を分化・成熟させる。この際、2Ｄ培養下と3D培養下デバソプレッシン（AVP）神経の分化効率に違いがあることに着目した。そこでAVP神経以外の神経細胞についても分化効率を比較したところ、３Ｄ培養の方が高効率で分化する細胞種、反対に２Ｄ培養下の方が高効率で分化する細胞種、および２D培養でも３Ｄ培養でも分化効率は変わらない細胞種があることが明らかとなった。このことから、2D培養と3D培養は、単純に神経分化効率に差があるばかりでなく、神経細胞の特異性を生み出す機構にも差異が生じていることが推測された。この差異を明らかにするため、培養14日目視床下部神経前駆細胞（PRE）、2D培養および３Ｄ培養でそれぞれ28日後の細胞からTotal RNAを生成しRNA-seqによりトランスクリプトーム解析を行った。その結果、Notchシグナル関連因子の他、AVP神経やオキシトシン（OXT）神経の細胞に関与することが知られているOtpやPou3f2等複数の遺伝子の発現が2D培養下と3Ｄ培養下で変化していることが明らかとなった。一方で、視床下部神経ダイレクト・リプログラミング法の開発のため、今年度はES細胞（EB5細胞株）を用いて、視床下部神経細胞分化に必要な遺伝子群の組合せの検討を行った。その結果、ある転写因子の組合せによりAVP神経、OXT神経の分化を誘導する事に成功した。

まず、SFEBq法による視床下部神経細胞分化の際の遺伝子発現変化をRT-qPCRで詳細に解析を行った。SFEBq法により培養14日目に視床下部神経前駆細胞が生じるが、その後は、細胞を分散処理して平面培養（2Ｄ培養）条件下、またはセルカルチャー・インサート上でオルガノイド様細胞塊のまま（3Ｄ培養）培養を継続し、視床下部神経を分化・成熟させる。この際、2Ｄ培養下と3D培養下デバソプレッシン（AVP）神経の分化効率に違いがあることに着目した。そこでAVP神経以外の神経細胞についても分化効率を比較したところ、３Ｄ培養の方が高効率で分化する細胞種、反対に２Ｄ培養下の方が高効率で分化する細胞種、および２D培養でも３Ｄ培養でも分化効率は変わらない細胞種があることが明らかとなった。このことから、2D培養と3D培養は、単純に神経分化効率に差があるばかりでなく、神経細胞の特異性を生み出す機構にも差異が生じていることが推測された。この差異を明らかにするため、培養14日目視床下部神経前駆細胞（PRE）、2D培養および３Ｄ培養でそれぞれ28日後の細胞からTotal RNAを生成しRNA-seqによりトランスクリプトーム解析を行った。その結果、Notchシグナル関連因子の他、AVP神経やオキシトシン（OXT）神経の細胞に関与することが知られているOtpやPou3f2等複数の遺伝子の発現が2D培養下と3Ｄ培養下で変化していることが明らかとなった。一方で、視床下部神経ダイレクト・リプログラミング法の開発のため、今年度はES細胞（EB5細胞株）を用いて、視床下部神経細胞分化に必要な遺伝子群の組合せの検討を行った。その結果、ある転写因子の組合せによりAVP神経、OXT神経の分化を誘導する事に成功した。