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iPS細胞のエクソソームを用いたT細胞制御による自己免疫疾患の新規治療法開発

使用 iPS 细胞外泌体通过 T 细胞控制开发自身免疫性疾病的新治疗方法

基本信息

批准号：
22K10221
负责人：
緒方謙一
金额：
$ 2.58万
依托单位：
Kyushu University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
财政年份：
2022
资助国家：
日本
起止时间：
2022-04-01 至 2025-03-31
项目状态：
未结题

项目摘要

1. iPS細胞作製についてロンザ社より購入したヒト歯髄幹細胞をメーカー指定の専用培地で80%コンフルエントになるまで培養した。細胞を回収した後、プラスミドDNA （Oct3/4、Sox2、Klf4、c-MycおよびDsRed）（OPTI-MEMTMI : Invitrogen社）を作用させたのち、PLAT-E 細胞に滴下し培養した。培養11目からpuromycin 選択を開始し、歯髄幹細胞由来のiPS細胞を3種類樹立した（iPS 1, iPS 2, iPS 3と定義）。また、未分化性の確認については、Oct3/4およびSSEA-4による蛍光免疫染色を施行した。2.iPS細胞からエクソソーム（EVs）回収について樹立した3種類のiPS細胞からEVs回収にあたっては、Cellartis; DEF-CS8482; 500 Culture System（タカラバイオ株式会社）を使用した。培養方法については、過去の報告に準じて行った。80%コンフルエント時にCellartis; MSC Xeno-Free Culture Medium（タカラバイオ株式会社）に培地交換し、48時間後にCMを回収した。回収したCMを超遠心機（himac CP80NX：日立工機）を用いて4℃、100000 × gで70分間超遠心した。これを4回繰り返したのち、PBSに再懸濁し、実験使用まで－80℃で保存した。れらのEVsの形態と表面マーカーを調べたところ、EVsの大きさはともに200 nm前後であり、表面マーカーはCD9, CD81をともに認めた（図1b）。よって、樹立したiPS細胞は未分化性を有し、かつ細胞能力に差があることが示された。また、それらからのEVsは大きさや表面マーカーに違いは認められなかった。

1. iPS cell production company Seoul purchased したヒト歯髄stem cells The ーカー designated の専 is cultivated with 80% コンフルエントになるまで. After the cells were recovered, the purified DNA (Oct3/4, Sox2, Klf4, c-Myc DsRed) (OPTI-MEMTMI: Invitrogen) was used and the PLAT-E cells were dropped and cultured. We started culturing 11-mesh puromycin and established 3 types of iPS cells (iPS 1, iPS 2, iPS 3 and definitions) from which stem cells were derived. Confirmation of undifferentiated properties, Oct3/4 SSEA-4 photoimmunostaining, and immunostaining were performed. 2. Recycling of iPS cells (EVs) and establishment of 3 types of iPS cells, Recycling of EVs, Cellartis; DEF-CS8482; 500 Culture System (タカラバイオ Co., Ltd.) is used. The training methods are accurate and the past reports are accurate and accurate. 80% コンフフエント时にCellartis;MSC The recycled CM super telecentric machine (himac CP80NX: Hitachi Koki) uses a 4°C, 100000 × g 70-minute super telecentric machine. Use これを4 times to return to the original state, resuspend in PBS, and store at -80℃.れらのEVsのmorphologyとsurfaceマーカーを动べたところ、EVsの大きさはともに200 nm front and backであり、surfaceマーカーはCD9, CD81をともに知めた(図1b). It is necessary to establish the undifferentiated nature of iPS cells and to show that the cell ability is poor.また、それらからのEVsは大きさやsurfaceマーカーにviolationいはcognizeめられなかった.