iPS細胞のエクソソームを用いたT細胞制御による自己免疫疾患の新規治療法開発

点击翻译按钮获取中文摘要

1. iPS細胞作製についてロンザ社より購入したヒト歯髄幹細胞をメーカー指定の専用培地で80%コンフルエントになるまで培養した。細胞を回収した後、プラスミドDNA （Oct3/4、Sox2、Klf4、c-MycおよびDsRed）（OPTI-MEMTMI : Invitrogen社）を作用させたのち、PLAT-E 細胞に滴下し培養した。培養11目からpuromycin 選択を開始し、歯髄幹細胞由来のiPS細胞を3種類樹立した（iPS 1, iPS 2, iPS 3と定義）。また、未分化性の確認については、Oct3/4およびSSEA-4による蛍光免疫染色を施行した。2.iPS細胞からエクソソーム（EVs）回収について樹立した3種類のiPS細胞からEVs回収にあたっては、Cellartis; DEF-CS8482; 500 Culture System（タカラバイオ株式会社）を使用した。培養方法については、過去の報告に準じて行った。80%コンフルエント時にCellartis; MSC Xeno-Free Culture Medium（タカラバイオ株式会社）に培地交換し、48時間後にCMを回収した。回収したCMを超遠心機（himac CP80NX：日立工機）を用いて4℃、100000 × gで70分間超遠心した。これを4回繰り返したのち、PBSに再懸濁し、実験使用まで－80℃で保存した。れらのEVsの形態と表面マーカーを調べたところ、EVsの大きさはともに200 nm前後であり、表面マーカーはCD9, CD81をともに認めた（図1b）。よって、樹立したiPS細胞は未分化性を有し、かつ細胞能力に差があることが示された。また、それらからのEVsは大きさや表面マーカーに違いは認められなかった。