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iPS細胞のエクソソームを用いたT細胞制御による自己免疫疾患の新規治療法開発

使用 iPS 细胞外泌体通过 T 细胞控制开发自身免疫性疾病的新治疗方法

基本信息

批准号：
22K10221
负责人：
緒方謙一
金额：
$ 2.58万
依托单位：
Kyushu University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
财政年份：
2022
资助国家：
日本
起止时间：
2022-04-01 至 2025-03-31
项目状态：
未结题

项目摘要

1. iPS細胞作製についてロンザ社より購入したヒト歯髄幹細胞をメーカー指定の専用培地で80%コンフルエントになるまで培養した。細胞を回収した後、プラスミドDNA （Oct3/4、Sox2、Klf4、c-MycおよびDsRed）（OPTI-MEMTMI : Invitrogen社）を作用させたのち、PLAT-E 細胞に滴下し培養した。培養11目からpuromycin 選択を開始し、歯髄幹細胞由来のiPS細胞を3種類樹立した（iPS 1, iPS 2, iPS 3と定義）。また、未分化性の確認については、Oct3/4およびSSEA-4による蛍光免疫染色を施行した。2.iPS細胞からエクソソーム（EVs）回収について樹立した3種類のiPS細胞からEVs回収にあたっては、Cellartis; DEF-CS8482; 500 Culture System（タカラバイオ株式会社）を使用した。培養方法については、過去の報告に準じて行った。80%コンフルエント時にCellartis; MSC Xeno-Free Culture Medium（タカラバイオ株式会社）に培地交換し、48時間後にCMを回収した。回収したCMを超遠心機（himac CP80NX：日立工機）を用いて4℃、100000 × gで70分間超遠心した。これを4回繰り返したのち、PBSに再懸濁し、実験使用まで－80℃で保存した。れらのEVsの形態と表面マーカーを調べたところ、EVsの大きさはともに200 nm前後であり、表面マーカーはCD9, CD81をともに認めた（図1b）。よって、樹立したiPS細胞は未分化性を有し、かつ細胞能力に差があることが示された。また、それらからのEVsは大きさや表面マーカーに違いは認められなかった。

1. iPS cell production is 80% of the time in culture. After the cells were recovered, PLAT-E cells were incubated with DNA (Oct3/4, Sox2, Klf4, c-Myc and DsRed)(OPTI-MEMTI: Invitrogen). Culturing 11 months after the initiation of puromycin selection, three types of iPS cells (iPS 1, iPS 2, iPS 3) were established from which stem cells originated. Immunostaining was performed for confirmation of undifferentiation, Oct3/4 and SSEA-4. 2. iPS Cell EVs Recovery System is used by Cellartis; DEF-CS8482; 500 Culture System (EVs Recovery System, Inc.). Training methods, past reports, etc. Cellartis; MSC Xeno-Free Culture Medium (Xeno-Free Culture Medium, Inc.) Himac CP 80NX: Hitachi Machinery Co., Ltd. 4 hours later, PBS was resuspended and stored at-80℃. EVs shape and shape, EVs shape and shape iPS cells are undifferentiated and have poor cell capacity.また、それらからのEVsは大きさや表面マーカーに违いは认められなかった。