ブタ脂肪前駆細胞におけるゲノム編集を用いた細胞分化制御メカニズムの解析

猪前脂肪细胞基因组编辑分析细胞分化控制机制

• 批准号: 26450454
• 负责人: 渡部 聡
• 金额: $ 3.24万
• 依托单位: National Institute of Agrobiological Sciences
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• 财政年份: 2014
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2014-04-01 至 2015-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-26450454/
• 关键词: ゲノム編集; EndoGalC; target toxin; 細胞選択法

近年、ゲノム編集技術が開発され、遺伝子改変を容易に行うことが可能になった。しかし、従来のノックアウト法とは異なりゲノム編集では薬剤耐性遺伝子を用いないため、遺伝子改変が起こった細胞を選択するために多大な手間と時間を要していた。そのため効率の良い新たな選択方法が求められていた。一方、新世界ザルより下等な生物は全て細胞表面にαGal抗原(Galα1-3Gal-R)という糖鎖構造を持つ。この糖鎖構造はBS-IB4というレクチンによって特異的に認識される。また、このレクチンにタンパク合成を阻害する毒素であるサポリンを結合させたIB4-SAPを動物細胞に作用させると、この物質が結合した細胞に細胞死を起こす。その濃度は0.4-1.0 μg/mlと極めて低濃度であり処理時間も30分間で十分である。また、Endo-β-galactosidase C (EndoGalC)はウェルシュ菌から単離されαGal抗原を特異的に切断する酵素である。この酵素遺伝子を動物細胞で発現させると細胞表面のαGal抗原を除去することができ、IB4-SAP処理による細胞死を回避できる。そこで、EndoGalC発現ベクターをhCas9発現ベクター、gRNA発現ベクターと細胞に共導入し、IB4-SAP処理を行うことで遺伝子改変細胞を濃縮する方法を開発した。これまでに、ブタ胎児繊維芽細胞、ブタ脂肪前駆細胞、マウス繊維芽細胞、マウスES細胞など、生物・細胞種を問わず遺伝子改変細胞の濃縮が確認でき、単離された細胞の約10％がbi-allelicなノックアウトであることが確認された。これらより、EndoGalCとIB4-SAPの組み合わせはCRISPRにおける遺伝子改変細胞の濃縮方法として非常に有効であることが示された。

In recent years, the technology of editing and editing has been launched, and it is easy to change the technology. In this way, you can choose how much time you want to use in order to change the size of your computer. Please select the method to determine the accuracy of the new method. On the other hand, the whole cell surface of Gal α 1-3Gal-R is stable in the production of glucose. Please tell me how to make a special knowledge of BS-IB4. In combination with IB4-SAP, the cells of animals and animals play an important role, and the cells are dead and dead. The temperature range is 0. 4-1. 0 μ g/ml. The operating time of low temperature temperature is very low. 30 minutes is very low. Endo- β-galactosidase C (EndoGalC), β-galactosidase (β-gal) and β-galactosidase (α-gal) were isolated from the bacteria. The enzyme enzyme was detected in the cells and the α-gal antigen on the cell surface was removed. The IB4-SAP antigen was removed and the cells died. Please check out the data of hCas9, gRNA, and IB4-SAP, and then change the method of cell registration. Cell cycle, fetal embryo maintenance cell, fat precursor cell, maternal ES cell cell, biological cell cell modification, cell cycle confirmation, and isolation of about 10% of the bi-allelic from the mother cell. This is the most important thing in this paper. In this case, we have a combination of CRISPR and SAP systems, which can be changed into cell phones. The method is very sensitive.

项目成果

Direct Injection of CRISPR/Cas9-Related mRNA into Cytoplasm of Parthenogenetically Activated Porcine Oocytes Causes Frequent Mosaicism for Indel Mutations.

将CRISPR/CAS9相关的mRNA直接注射到孤肠遗传激活的猪卵母细胞中，导致频繁的镶嵌物引起诱因突变。

• DOI: 10.3390/ijms160817838
• 发表时间: 2015-08-03
• 期刊: International journal of molecular sciences
• 影响因子: 5.6
• 作者: Sato M;Koriyama M;Watanabe S;Ohtsuka M;Sakurai T;Inada E;Saitoh I;Nakamura S;Miyoshi K
• 通讯作者: Miyoshi K

A combination of targeted toxin technology and the piggyBac-mediated gene transfer system enables efficient isolation of stable transfectants in nonhuman mammalian cells

• DOI: 10.1002/biot.201400283
• 发表时间: 2015-01-01
• 期刊: BIOTECHNOLOGY JOURNAL
• 影响因子: 4.7
• 作者: Sato, Masahiro;Inada, Emi;Watanabe, Satoshi
• 通讯作者: Watanabe, Satoshi

EndGalCとIB4-SAPの組み合わせを用いたCRISPR遺伝子による遺伝子改変細胞濃縮法の開発

结合 EndGalC 和 IB4-SAP 开发使用 CRISPR 基因富集转基因细胞的方法

• 发表时间: 2014
• 作者: 渡部 聡;桜井敬之;中村伸吾;梶原景正;木村 穣;佐藤正宏
• 通讯作者: 佐藤正宏