Efficient production of CD46 knockout pigs by using adeno-associated virus vectors carrying the CRISPR / Cas9 system

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申請者は、アデノ随伴ウイルスに黄色ブドウ球菌由来のCas9(saCas9)遺伝子とガイドRNA遺伝子を搭載したベクター(AAV-CRISPR)を作成し、ブタで豚コレラウイルス(SFV)受容体で免疫系細胞の表面に存在するCD46タンパクの遺伝子をノックアウトし、SFVに感染しないブタを作製する研究に着手した。令和2年度は、saCas9が哺乳類細胞で機能するか確認するため、マウスチロシナーゼ遺伝子に対するgRNAとsaCas9遺伝子を搭載したAAV-CRISPRを、マウス黒色腫に感染させる実験を行った。その結果、メラニン合成が減少し細胞色が白色となりウエスタンブロッティングでもチロシナーゼ産生が著しく減少することを確認した。この結果から、saCas9は哺乳類細胞でも機能することを確認した。また、EGFP遺伝子を搭載したAAVをマウス受精卵にin vitroで感染させたところ、これらの受精卵は緑色の蛍光を発しAAVが哺乳類の受精卵に感染できることが明らかになった。また、これまでブタのCD46と反応する抗体はなく、このタンパクの存在や動態を確認できなかった。そこで我々は、SFVのキャプシッドタンパク遺伝子の中でCD46に結合するE2領域とEGFP遺伝子の融合合成遺伝子を作成しこれを培養細胞で発現させ、融合タンパクを作らせて精製しCD46の存在を調べる方法を考案した。E2-EGFP遺伝子を293T細胞に導入したところ、その培養上清から強い蛍光を発するタンパクのフラクションを得られた。このタンパクを、ブタ胸腺から採取した初代培養細胞に反応させたところ、細胞表面に蛍光を示す細胞が観察されE2-EGFP融合タンパクが免疫系の細胞表面に存在するCD46と結合することが示唆された。今後これらのツールを使用して研究を推進していく予定であったが異動となり、本課題を中止することとなった。