In vitro機能・構造解析のための核内外膜の分画の試み

尝试分离核膜和外膜以进行体外功能和结构分析

• 批准号: 08878093
• 负责人: 渡邊 誠
• 金额: --
• 依托单位: 大分医科大学
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Exploratory Research
• 财政年份: 1996
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1996 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-08878093/
• 关键词: Saccharomyces cerevisiae; Nuclear envelope; Outernuclear membrane; Inner nuclear membrane

核膜は酵母(Saccharomyces cerevisiae)から以下の通り調製した。Saccharomyces cerevisiaeを培養後、集菌し、酵素処理によりSpheroplast化し、それをFicollを用いて再度集めた。ホモジナイザーによりSpheroplastを破砕し、蔗糖密度勾配遠心により核を回収し、DNaseで処理後蔗糖密度勾配にかけ核膜を得た。得られた核膜は抗lamin B receptor抗体によるイムノブロットから内膜を有し、かつprepro α Factorを透過させるタンパク質膜透過能を有することから外膜を有すること、つまり内外膜が共存していることが確認された。この核膜画分は蔗糖密度勾配上、signal peakを呈した。この核膜画分をFrench pressにより破砕し、それを蔗糖密度勾配遠心にかけ分画を試みたところ、内外膜が共存しているpeakに加え、外膜を主要成分とする画分と内膜を主要成分とする画分とが識別された。しかし外膜及び内膜の画分の収率が低値と、各画分の分離が不十分という二つの問題点が存在する。現在French press処理の段階について加圧の程度及びその際の緩衡液の組成について検討中であり、超音波処理も検討している。分離を向上させるためには蔗糖密度の条件を検討中であるが、沈降法に加え浮遊法も試みている。さらに蔗糖以外による密度勾配も検討中である。より混在物の少ない外膜画分を得る方法として、外膜にはライボソーム結合能が存在することに着目して、French press処理後の試料に酵母から調製したライボソーム画分を加え、この存在下で蔗糖密度勾配遠心を行い、ライボソーム結合により重い画分に移行した膜成分を得た。これから高塩濃度処理によりライボソームを除去し、極めて純度が高い外膜を得ることに成功した。

The nuclear membrane yeast (Saccharomyces cerevisiae) was isolated from the following cells. After Saccharomyces cerevisiae culture, the bacteria were collected, the enzyme was Spheroplast, and the Ficoll was collected again. The sucrose density was linked to the core, the nucleus, the core, and the nuclear membrane after DNase treatment. The nuclear membrane, anti-lamin B receptor antibody, anti-lamin B receptor antibody, anti-Tunica intima, prepro α Factor, Tunica adventitia, intima, intima, intima, The nuclear membrane was divided into sucrose density and signal peak. Nuclear membrane painting is divided into French press, sucrose density, heart, intima, adventitia, intima, intima. The rate of separation of adventitia and intima is low, and the separation of each painting is not very high. At present, there is an increase in the degree of increase in the level of stress in the French press system and the composition of the balance fluid in the system. Separate the sucrose density condition from the floating method and add the floating method. In addition to sucrose, the density is matched in the medium temperature. In this paper, the results of the method and the combination of the adventitia and the adventitia were analyzed, and the results showed that there were significant differences in the concentration of yeast, the concentration of yeast, the density of sucrose, the density of sucrose and the composition of the membrane. The temperature is very high, and the adventitia is very high.