微生物のゲノム上における化学物質によるDNA損傷パターンと突然変異の関係の解明

阐明化学诱导的 DNA 损伤模式与微生物基因组突变之间的关系

• 批准号: 09877086
• 负责人: 吉田 吏江
• 金额: $ 0.77万
• 依托单位: Jikei University School of Medicine
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Exploratory Research
• 财政年份: 1997
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1997 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-09877086/
• 关键词: DNA損傷; 活性酸素; 8-oxodG; formamidopyrimidine glycosylase

細菌のDNA損傷検出系を作製するため、高分子DNAを電気泳動し、泳動像を解析することによりDNA損傷の検出ができるよう、まず大腸菌より単離したDNAを用いてのシステム作りを試みた。菌は人為的な損傷をさけるためゲル中に包埋し、膜、蛋白質を融解し、DNAを抽出した。その後、活性酸素生成系としてH_2O_2と金属(Fe,Cu)をDNAに曝露し、巨大DNA泳動装置(GENOFIELD)を用いて電気泳動を行った。ここで、酸化的DNA損傷の指標である8-oxodG検出のため、泳動前に酵素formamidopyrimidine glycosylase処理を行った。この酵素は8-oxodG部位を特異的に切断するため、塩基の損傷を切断の形に換えることができる。この酵素処理の後、アルカリアガロースゲル電気泳動を行った。泳動後、DNAはethidium bromideで染色し、泳動像のデンシトグラムを作製し、以下のように解析した。試料、マーカーDNAの各レーンの泳動像から、DNA分子長と移動位置の関係が得られ、曲線の定量的画像データから各レーンの平均分子長数(Ln)を次式より計算した:Ln^<-1>={∫(p(x)・dx)/L(x)}/∫p(x)・dx ここでL(x)は位置(x)に移動したDNA分子の長さであり、p(x)は仕置xに移動したDNA分子と結合したethidium bromideの蛍光の強さである。各レーンのLnの算出後、各曝露群において、{酵素処理あり(+)のLn^<-1>一酵素処理なし(-)のLn^<-1>}を求め、{コントロール(+)のLn^<-1>-コントロール(-)のLn^<-1>}をさらに差し引くことにより8-oxodGを検出した。現時点では実験ごとに検出された損傷量のばらつきが大きい。最近strand breakの検出に、より適するといわれているNeutral glyoxal gelの使用など今後改良を重ねていくことが必要である。

DNA damage detection system of bacteria, polymer DNA, electromigration, migration image analysis, DNA damage detection system of E. coli, DNA damage detection system, DNA damage detection system The bacteria were damaged by human factors, such as embedding, membrane, protein melting and DNA extraction. After that, the active acid production system was used to expose DNA to H_2O_2 and metals (Fe,Cu), and the giant DNA electrophoresis device (GENOFIELD) was used to conduct electromigration. 8-oxodG detection, enzyme formamidopyrimidine glycosylase treatment before swimming The enzyme is 8-oxodG site-specific, and its base is damaged. After the enzyme treatment, the enzyme was removed from the cell. After swimming, DNA staining with ethidium bromide, swimming image processing, and the following analysis The relationship between the length of DNA molecules and the moving position of DNA molecules is calculated by the following equation:Ln^<-1>={p(x)·dx)/L(x)}/dx·d After calculation of Ln for each exposure group, the difference between Ln (+) and <-1>Ln (<-1>-<-1>) for each exposure group is determined<-1>. The current point is to detect the damage amount and to detect the damage amount. Recent strand breaks have been found, and the use of Neutral glyoxal gel has been improved in the future