低温酵素(Psychrophilic enzyme)の分子機能に関する研究

嗜冷酶的分子功能研究

• 批准号: 09876027
• 负责人: 相薗 泰生
• 金额: $ 0.32万
• 依托单位: Kobe University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Exploratory Research
• 财政年份: 1997
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1997 至 1998
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-09876027/
• 关键词: 低温酵素; 低温酵素の分離精製; 低温酵素の熱安定性; 低温アルカリホスファターゼ; 低温蛋白質チロシンホスファターゼ; 好冷菌産生酵素; 低温ホスファターゼ; 低温酵素の至適温度・pH

低温域(0〜5°C)で作用する酵素の触媒機能を高次構造との関連で解明する研究の一環として、好冷菌(Shewanella sp.)が産生するアルカリフォスファターゼに着目して、その分離精製を行い、精製酵素について酵素化学的及び理化学的性質を明らかにした。●アルカリフォスファターゼ(AP)の分離精製:菌体(2Kg)を磨砕して得られた酵素抽出液を、硫酸アンモニウム40-80%飽和で粗分画した後、順次、DEAE-ce11ulofine、Butyl-cellulofine、Hydroxylapatite、Sephacryl S-100、Mono-Qを用いたカラムクロマトグラフィーに供し、Native-PAGE及びSDS-PAGEで均一な酵素標品1.04mg(比活性:1394)を活性収率13.1%で分離した。●APの酵素化学的特性:精製酵素は、至適pH9.8、至適温度40℃を示し、pH9.8、温度0〜10℃の範囲で安定であったが、20℃以上で失活する特性を示した。本酵素は、金属イオンを要求し、Mg^<2+>、Mn^<2+>及びCo^<2+>により活性が高められた。0℃における活性は、40℃(至適温度)の39%を示した。また、幅広い基質特異性を示し、ATP、GTP、CTP、β-Glycerophosphateなどを脱リン酸化した。●APの理化学的特性:SDS-PAGE及びアミノ酸組成分析で測定された分子量は、41,800であった。また、精密アミノ酸組成分析により、この酵素は、高次構造の安定化因子であるプロリン残基の含量が低く、また、分子内に1つのジスルフィド結合を有していることが明らかになった。これらの特性が、この酵素の中温域における不安定性と低温域における高い触媒活性に寄与しているものと推測された。●Phosphatase Iの酵素化学的特性:昨年、同じ菌株から単離したPhosphatase Iについて、基質特異性と、また化学修飾により触媒残基を詳細に検討し、本酵素は、Hisを触媒残基とするProtein-tyrosine-phosphataseであることを明らかにした。

作为一项研究的一部分，以阐明在低温（0-5°C）上与高阶结构有关的酶的催化功能，我们重点介绍了由脊椎细菌（Shewanella sp。）产生的碱性磷酸酶（Shewanella sp。），并分离和纯化，并揭示了它们的化学和物理学性质。 ●Separation and purification of alkaline phosphatase (AP): The enzyme extract obtained by grinding the bacteria (2kg) was crude and was crudely fractionated at 40-80% saturation of ammonium sulfate, and then successively subjected to column chromatography using DEAE-ce11ulofine, Butyl-cellulofine, Hydroxylapatite, Sephacryl S-100, and通过天然页面和SDS-PAGE的单Q和同质酶制剂1.04 mg（特定活性：1394），活性产率为13.1％。 ●AP的酶化学特性：纯化的酶的最佳pH值为9.8，最佳温度为40°C，稳定在9.8的pH范围内，温度为0至10°C，但在20°C或更高范围内表现出均匀的特性。该酶需要金属离子，并通过mg^<2+>，mn^<2+>和co^<2+>增加。 0°C的活性为40°C的39％（最佳温度）。它还表现出广泛的底物特异性，并具有去磷酸化的ATP，GTP，CTP，β-甘油磷酸酯等。 ●AP的物理和化学特性：通过SDS-PAGE和氨基酸组成分析测量的分子量为41,800。此外，精度氨基酸成分分析表明，该酶的脯氨酸残基含量较低，脯氨酸残基是稳定的高阶结构因子，并且在分子内具有一个二硫键。据推测，这些特性在该酶的中温度和低温范围内的高催化活性中有助于不稳定。 ●磷酸酶I的酶化学特性：去年，我们研究了去年从同一菌株中分离出的磷酸酶I的底物特异性和催化残基，并揭示了该酶是一种蛋白质酪氨酸 - 磷酸酶，其作为催化残基。