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糸状菌由来のシアン非感受性呼吸系酵素遺伝子を利用した大腸菌の代謝機能改変

使用源自丝状真菌的氰化物不敏感呼吸酶基因修饰大肠杆菌的代谢功能

基本信息

批准号：
08750932
负责人：
桐村光太郎
金额：
$ 0.64万
依托单位：
Waseda University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
财政年份：
1996
资助国家：
日本
起止时间：
1996 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

Aspergillus niger(クロコウジカビ)のシアン非感受性呼吸系は、シアンやアンチマイシンAに非感受性でサリチルヒドロキサム酸に感受性を示す。このような呼吸系を構成する酵素はalternative oxidaseと呼ばれているが、一部の植物と真核微生物のものを除いて当該酵素の性質や遺伝子構成は不明である。本研究においては、A.nigerのシアン非感受性呼吸系酵素の遺伝子レベルでの存在の実証を目的として、alternative oxidaseをコードする相補DNA(以下cDNAと略)を取得し塩基配列を決定した。さらに、当該cDNAを大腸菌で発現させた。シアン非感受性呼吸活性が強く現れるような条件下で培養したA.nigerの菌体よりメッセンジャーRNAを抽出し、これに逆転写酵素を作用させてcDNAライブラリーを作成した。植物で塩基配列が決定されているalternative oxidase遺伝子の保存配列を調べ、相当するDNAプローブを合成してcDNAライブラリーよりA.niger alternative oxidaseをコードするcDNAを取得した。当該cDNAは1053bpから成り分子量約39kDaのタンパク質をコードすることが判明した。植物のそれとは塩基レベルで約50%、アミノ酸レベルで約70%の相同性を示した。当該cDNAより予想されるタンパク質のN末端付近にはミトコンドリア移行シグナルが存在した。つぎに、IPTGの存在下で発現が誘導される発現ベクターpkk223-3に当該cDNAを組込み、大腸菌DH5αを形質転換した。このキメラプラスミドを有する形質転換体にはIPTGの誘導条件下でシアンやアンチマイシンAに非感受性でサリチルヒドロキサム酸に感受性を示す呼吸が出現した。

Aspergillus niger(Aspergillus niger) is A non-susceptible respiratory system. It is a non-susceptible respiratory system. It is a sensitive respiratory system. The enzyme is an alternative oxidase and the enzyme composition is unknown in plants and eukaryotic microorganisms. In this study, the gene sequence of A.niger, a non-susceptible respiratory enzyme, was confirmed to exist for the purpose of obtaining complementary DNA for alternative oxidase (hereinafter abbreviated cDNA) and determining its gene sequence. Today, when the cDNA is produced in E. coli. A.niger cells were cultured under conditions where the non-responsive respiratory activity was strong and the reverse transcription enzyme was active. The gene sequence of A.niger alternative oxidase was determined by DNA sequencing and cDNA sequencing. When the cDNA is 1053bp long, the molecular weight is about 39kDa. About 50% of the plants are identical to each other, and about 70% are identical to each other. When the cDNA fragment is expected to be present near the N-terminal region of the protein, it is not present. In the presence of IPTG, it was induced by pkk223 -3. When the cDNA was cloned, Escherichia coli DH5 α was transformed. Under IPTG induction conditions, the non-susceptible cells showed respiratory activity.