遺伝子タギング法によるトマトアルターナリア茎枯病菌の病原性遺伝子のクローニング

本研究は、トマトアルターナリア茎枯病菌(Alternaria alternata tomato pathotype)を用いて、Restriction Enzyme Mediated Integration(REMI)を利用した遺伝子タギング法により、本来の病原性(力)が変化した突然変異体を取得した後、変異体から、その表現形、すなわち病原性(力)に関与する遺伝子のクローニングを行い、他の遺伝子との相同性解析、遺伝子破壊などの手法を用いてその機能を明らかにすることを目的とする。まず、茎枯病菌に対してREMI法による形質転換を行い、プラスミドの組込によってタッグした変異体のライブラリー(REMIライブラリー)を作成した。プラスミドの組込み様式を解析した結果、REMI法により、通常のプラスミドタギングと比較して、形質転換頻度が上昇し、組込み様式が単純になることが示され、REMI法の有効性が確認された。このREMIライブラリーより、感受性トマト葉を用いた生物検定法およびHPLC分析による毒素定量法を利用して、毒素生産に関する変異体のスクリーニングを行った。その結果、約1000個の形質転換体より3個体の毒素非生産変異体が得られた。さちに、これら変異体の接種実験の結果、毒素非生産変異体は、感受性トマトに対する病原性も失活していることが示され、毒素生産能と病原牲の相関が明確となった。現在、変異体のゲノムDNAより、プラスミドが挿入された近傍のDNA断片をPCR法により回収し、その毒素生産との関わり合いを検討中である。

本研究は、トマトアルターナリア茎枯病菌(Alternaria alternata tomato pathotype)を用いて、Restriction Enzyme Mediated Integration(REMI)を利用した遺伝子タギング法により、本来の病原性(力)が変化した突然変異体を取得した後、変異体から、その表現形、すなわち病原性(力)に関与する遺伝子のクローニングを行い、他の遺伝子との相同性解析、遺伝子破壊などの手法を用いてその機能を明らかにすることを目的とする。まず、茎枯病菌に対してREMI法による形質転換を行い、プラスミドの組込によってタッグした変異体のライブラリー(REMIライブラリー)を作成した。プラスミドの組込み様式を解析した結果、REMI法により、通常のプラスミドタギングと比較して、形質転換頻度が上昇し、組込み様式が単純になることが示され、REMI法の有効性が確認された。このREMIライブラリーより、感受性トマト葉を用いた生物検定法およびHPLC分析による毒素定量法を利用して、毒素生産に関する変異体のスクリーニングを行った。その結果、約1000個の形質転換体より3個体の毒素非生産変異体が得られた。さちに、これら変異体の接種実験の結果、毒素非生産変異体は、感受性トマトに対する病原性も失活していることが示され、毒素生産能と病原牲の相関が明確となった。現在、変異体のゲノムDNAより、プラスミドが挿入された近傍のDNA断片をPCR法により回収し、その毒素生産との関わり合いを検討中である。