in situハイブリダイゼーション法を利用したカンキツ不定胚形成過程の解析

本研究では、in situハイブリダイゼーション法の植物材料への適用を念頭におき、そのプロトコールの確立を中心に行った。計画の最終目標であったin situのPCRのプロトコールの確立には成功しなかったが、手順中の重要なステップである新しい包理法による切片作製および蛍光色素による染色に成功し、また、PCRの最適条件の検討も行った。得られた結果の概要は以下の通りである。1.組織形態学的手法として、テクノビット樹脂を用いた包理法を確立した。従来用いられてきたパラフィン包理法によって作製したプレパラートと比較して、組織・細胞の保存性に著しく優れていた。また、毒性のある薬品の使用が少なかったうえ、迅速な切片作製が可能であった点、現在最も一般的な樹脂であるスパー樹脂による包理法よりも利用価値が高いものと思われた。2.テクノビットによって作製した切片の染色性を確認するため、DAPIおよびCalcofluor Whiteで染色を行った。その結果両蛍光色素とも十分に利用できることを確認した。3.分子生物学的手法としてDNA増幅装置(PCR)の最適反応条件の検討を行った。PCRの利用経験はわずかであったので、既存のデータのあるカランボラの葉を材料に手法の確認を行った。DNAの抽出法としていくつかの方法を試みたが、その中で、PEGを用いて多糖類を除去した後、SDSとCTABを併用する方法がもっとも効率的に全DNAを抽出できた。RAPD法によってカランボラ12系統の識別が可能かどうかを検討した結果、確実な系統間識別が可能であることがわかり、PCRの反応溶液組成および設定条件の妥当性が確認された。

本研究では、in situハイブリダイゼーション法の植物材料への適用を念頭におき、そのプロトコールの確立を中心に行った。計画の最終目標であったin situのPCRのプロトコールの確立には成功しなかったが、手順中の重要なステップである新しい包理法による切片作製および蛍光色素による染色に成功し、また、PCRの最適条件の検討も行った。得られた結果の概要は以下の通りである。1.組織形態学的手法として、テクノビット樹脂を用いた包理法を確立した。従来用いられてきたパラフィン包理法によって作製したプレパラートと比較して、組織・細胞の保存性に著しく優れていた。また、毒性のある薬品の使用が少なかったうえ、迅速な切片作製が可能であった点、現在最も一般的な樹脂であるスパー樹脂による包理法よりも利用価値が高いものと思われた。2.テクノビットによって作製した切片の染色性を確認するため、DAPIおよびCalcofluor Whiteで染色を行った。その結果両蛍光色素とも十分に利用できることを確認した。3.分子生物学的手法としてDNA増幅装置(PCR)の最適反応条件の検討を行った。PCRの利用経験はわずかであったので、既存のデータのあるカランボラの葉を材料に手法の確認を行った。DNAの抽出法としていくつかの方法を試みたが、その中で、PEGを用いて多糖類を除去した後、SDSとCTABを併用する方法がもっとも効率的に全DNAを抽出できた。RAPD法によってカランボラ12系統の識別が可能かどうかを検討した結果、確実な系統間識別が可能であることがわかり、PCRの反応溶液組成および設定条件の妥当性が確認された。