ハイブリッドエピゲノム編集法によるin vitro精子形成技術の開発

本研究では、エピゲノム編集技術を用いた胚性幹細胞から精母細胞への分化誘導法の確立を目的とする。哺乳類の精子形成では、減数分裂期へ移行する際に体細胞型の遺伝子発現プロファイルから精子形成期特有の遺伝子発現プロファイルへと切り替わる。申請者は、マウス精子形成をモデルにこの大規模な遺伝子発現変化が減数分裂移行期の段階的なクロマチン構造変化によってもたらされることを明らかにした。次に、この精子形成の進行に重要なクロマチン動態が生物種間で保存された現象なのかという点に着目した。さらに、種間で共通して精子形成の進行に重要な領域を標的に、人為的に体細胞分裂型から減数分裂型のクロマチン状態に編集することで、in vitroで減数分裂への移行を制御できるのではと考えた。そこで本研究ではまず、抑制型及び活性化型のエピゲノム編集を同時に行う新規のエピゲノム編集技術の確立を進めた。本項目では、ddCas12aを用いたCRISPRoff法による抑制型およびdCas9を用いたCRISPRa法による活性化型のエピゲノム編集を行うためのプラスミドベクターを作製し、CRISPRoff、CRISPRa融合タンパク質の活性をレポーターアッセイにより評価する。現在までに、ddAsCas12aを用いたCRISPRoff法による抑制生のエピゲノム編集を行うためのプラスミドベクターを作製した。作製したCRISPRoffベクターをHEK293FT培養細胞にトランスフェクションし、抗HA抗体を用いたウェスタンブロッティング法によりCRISPRoff融合タンパク質の発現を確認した。

本研究では、エピゲノム編集技術を用いた胚性幹細胞から精母細胞への分化誘導法の確立を目的とする。哺乳類の精子形成では、減数分裂期へ移行する際に体細胞型の遺伝子発現プロファイルから精子形成期特有の遺伝子発現プロファイルへと切り替わる。申請者は、マウス精子形成をモデルにこの大規模な遺伝子発現変化が減数分裂移行期の段階的なクロマチン構造変化によってもたらされることを明らかにした。次に、この精子形成の進行に重要なクロマチン動態が生物種間で保存された現象なのかという点に着目した。さらに、種間で共通して精子形成の進行に重要な領域を標的に、人為的に体細胞分裂型から減数分裂型のクロマチン状態に編集することで、in vitroで減数分裂への移行を制御できるのではと考えた。そこで本研究ではまず、抑制型及び活性化型のエピゲノム編集を同時に行う新規のエピゲノム編集技術の確立を進めた。本項目では、ddCas12aを用いたCRISPRoff法による抑制型およびdCas9を用いたCRISPRa法による活性化型のエピゲノム編集を行うためのプラスミドベクターを作製し、CRISPRoff、CRISPRa融合タンパク質の活性をレポーターアッセイにより評価する。現在までに、ddAsCas12aを用いたCRISPRoff法による抑制生のエピゲノム編集を行うためのプラスミドベクターを作製した。作製したCRISPRoffベクターをHEK293FT培養細胞にトランスフェクションし、抗HA抗体を用いたウェスタンブロッティング法によりCRISPRoff融合タンパク質の発現を確認した。