高次脳機能を司るCaMKIIタンパク質の細胞内局所特異的な活性制御法の開発

开发特异性控制 CaMKII 蛋白细胞内活性的方法，该蛋白控制高级脑功能

• 批准号: 22KJ1605
• 负责人: 曽我 恭平
• 金额: $ 1.6万
• 依托单位: Nagoya University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• 财政年份: 2023
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2023-03-08 至 2025-03-31
• 项目状态: 未结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-22KJ1605/
• 关键词: CaMKII; 分子濃縮

CaMKIIは神経細胞において記憶分子として知られる重要なタンパク質であるが、細胞内の別々の部位に局在する4つのサブユニットはその相同性の高さから従来の阻害剤では制御しわけることはできない。従ってCaMKIIが発現する細胞内局所における活性制御は記憶のメカニズムの解明につながる。本手法では、小分子化合物を細胞内局所選択的に「分子濃縮する」ことを発案した。monobodyという人工抗体に着目し、最初はリガンドがmonobodyに分子濃縮され、続いて細胞内でCaMKIIに分子交換されることで、実現可能だと考えた。令和4年度では、CaMKIIと人工抗体monobodyに結合可能なデザイナーリガンドの合成を行った。CaMKII結合部位、monobody結合部位はそれぞれ2種類の組み合わせのリガンドを合成した。CaMKII精製タンパク質を用いた実験で、既報の阻害剤と同程度にCaMKIIを阻害できることがわかった。また、プルダウンアッセイによる競合阻害実験によりmonobodyに数百nMで結合できることを確認した。また、HEK293T細胞に強制発現させたCaMKIIを阻害できることをウエスタンブロッティングにより確認した。しかし、十分に阻害することはできず、リガンドの細胞膜透過性が不十分であることがわかった。細胞種をHeLa細胞やプライマリーの海馬培養神経細胞で行うと、阻害がかかりやすいことから、今後それらの細胞を用いていくことを考えている。

CaMKII は god 経 cells に お い て memory molecule と し て know ら れ る important な タ ン パ ク qualitative で あ る が, intracellular の don't 々 の parts に bureau in す る 4 つ の サ ブ ユ ニ ッ ト は そ の identity の high さ か ら 従 to の resistance against tonic で は suppression し わ け る こ と は で き な い. Youdaoplaceholder0 CaMKIIが shows する intracellular local における activity, which controls <s:1> memory メカニズム and explains に ながる ながる. This technique で で, the intracellular authorities of small molecule compounds を, select 択 of に "molecular concentration する", とを とを, which is involved in た. Monobody と い う artificial antibodies に mesh し, initially は リ ガ ン ド が monobody に molecule concentration さ れ, 続 い て in cells で CaMKII に molecules exchange さ れ る こ と で, may be now だ と exam え た. Make and 4 year で は, CaMKII と artificial antibodies monobody に combination may な デ ザ イ ナ ー リ ガ ン ド の synthetic line を っ た. The CaMKII binding site and the monobody binding site それぞれ two types of groups み are combined with わせ <s:1> リガ ドを ドを ドを ドを ドを to synthesize た た. CaMKII refined タ ン パ ク qualitative を with い た be 験 で, both reported の resistance against tonic と with degree に CaMKII を resistance against で き る こ と が わ か っ た. ま た, プ ル ダ ウ ン ア ッ セ イ に よ る co-opetition resistance against be 験 に よ り monobody に hundreds of nM で combining で き る こ と を confirm し た. ま た, compulsory 発 に HEK293T cells presently さ せ た CaMKII を resistance against で き る こ と を ウ エ ス タ ン ブ ロ ッ テ ィ ン グ に よ り confirm し た. し か し, very に resistance against す る こ と は で き ず, リ ガ ン ド の cell membrane permeability が not quite で あ る こ と が わ か っ た. Cells of を HeLa や プ ラ イ マ リ ー の cultivate god 経 hippocampus cell line で う と, resistance against が か か り や す い こ と か ら, future そ れ ら の cells を using い て い く こ と を exam え て い る.