哺乳動物FoF1ATP合成酵素全体の構造解析によるエネルギー変換の原子機構解明

本研究では、FoF1ATP合成酵素四量体(テトラマー)全体を安定化させ、その機能する全長を高分解能X線結晶構造解析すること、さらには、クライオ電子顕微鏡（クライオ電顕）を用い、単粒子静的構造解析及び溶液中の本酵素の経時変化（動的立体構造）を明らかにし、本酵素の働きについて、詳細なメカニズムを解明することを研究計画としていた。まず、高分解能構造学解析のために、試料調製に重点を置き研究を行った結果、本酵素モノマー、ダイマー、テトラマー、オリゴマーを安定に精製することに成功した。また、この方法で得られた本酵素は、溶液条件を最適化することで、ミトコンドリア内膜で存在するオリゴマー形態に戻すことができた（未発表）。可溶化によってオリゴマーでなくなった本酵素をin vitroで、もう一度オリゴマーに戻すことができたのは、世界で初めてであり、精製された本酵素が無傷で安定であるという証拠である。加えて、申請者は、哺乳動物のウシからだけでなく、ヒトの本酵素の精製方法も確立した。その成果は、京都大学から物質特許として出願し、2022年９月にはP C T出願された。次に、この精製方法で得られた試料に対してクライオ電顕観察を始めた。クライオグリッド作製のために精製過程で用いたショ糖の除去（溶液交換）や濃縮を行う必要があった。本酵素は透析も濃縮膜も使用することができなかったため、別の方法を開発し（未発表）、クライオグリッドの作製に成功した。クライオ電顕を用いて、哺乳動物ミトコンドリアFoF1ATP合成酵素テトラマーの単粒子構造解析を共同研究により行なった結果、現在、全体では約６オングストーム、FoF1モノマーにフォーカスすると、3.6オングストローム分解能の構造を得ている。

本研究では、FoF1ATP合成酵素四量体(テトラマー)全体を安定化させ、その機能する全長を高分解能X線結晶構造解析すること、さらには、クライオ電子顕微鏡（クライオ電顕）を用い、単粒子静的構造解析及び溶液中の本酵素の経時変化（動的立体構造）を明らかにし、本酵素の働きについて、詳細なメカニズムを解明することを研究計画としていた。まず、高分解能構造学解析のために、試料調製に重点を置き研究を行った結果、本酵素モノマー、ダイマー、テトラマー、オリゴマーを安定に精製することに成功した。また、この方法で得られた本酵素は、溶液条件を最適化することで、ミトコンドリア内膜で存在するオリゴマー形態に戻すことができた（未発表）。可溶化によってオリゴマーでなくなった本酵素をin vitroで、もう一度オリゴマーに戻すことができたのは、世界で初めてであり、精製された本酵素が無傷で安定であるという証拠である。加えて、申請者は、哺乳動物のウシからだけでなく、ヒトの本酵素の精製方法も確立した。その成果は、京都大学から物質特許として出願し、2022年９月にはP C T出願された。次に、この精製方法で得られた試料に対してクライオ電顕観察を始めた。クライオグリッド作製のために精製過程で用いたショ糖の除去（溶液交換）や濃縮を行う必要があった。本酵素は透析も濃縮膜も使用することができなかったため、別の方法を開発し（未発表）、クライオグリッドの作製に成功した。クライオ電顕を用いて、哺乳動物ミトコンドリアFoF1ATP合成酵素テトラマーの単粒子構造解析を共同研究により行なった結果、現在、全体では約６オングストーム、FoF1モノマーにフォーカスすると、3.6オングストローム分解能の構造を得ている。