哺乳動物FoF1ATP合成酵素全体の構造解析によるエネルギー変換の原子機構解明

通过整个哺乳动物 FoF1ATP 合酶的结构分析阐明能量转换的原子机制

基本信息

批准号：
22KJ1638
负责人：
慈幸千真理
金额：
$ 2.58万
依托单位：
Kyoto University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2023
资助国家：
日本
起止时间：
2023-03-08 至 2024-03-31
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-22KJ1638/
关键词：
ATP合成酵素ミトコンドリア単粒子構造解析膜蛋白質複合体

项目摘要

本研究では、FoF1ATP合成酵素四量体(テトラマー)全体を安定化させ、その機能する全長を高分解能X線結晶構造解析すること、さらには、クライオ電子顕微鏡（クライオ電顕）を用い、単粒子静的構造解析及び溶液中の本酵素の経時変化（動的立体構造）を明らかにし、本酵素の働きについて、詳細なメカニズムを解明することを研究計画としていた。まず、高分解能構造学解析のために、試料調製に重点を置き研究を行った結果、本酵素モノマー、ダイマー、テトラマー、オリゴマーを安定に精製することに成功した。また、この方法で得られた本酵素は、溶液条件を最適化することで、ミトコンドリア内膜で存在するオリゴマー形態に戻すことができた（未発表）。可溶化によってオリゴマーでなくなった本酵素をin vitroで、もう一度オリゴマーに戻すことができたのは、世界で初めてであり、精製された本酵素が無傷で安定であるという証拠である。加えて、申請者は、哺乳動物のウシからだけでなく、ヒトの本酵素の精製方法も確立した。その成果は、京都大学から物質特許として出願し、2022年９月にはP C T出願された。次に、この精製方法で得られた試料に対してクライオ電顕観察を始めた。クライオグリッド作製のために精製過程で用いたショ糖の除去（溶液交換）や濃縮を行う必要があった。本酵素は透析も濃縮膜も使用することができなかったため、別の方法を開発し（未発表）、クライオグリッドの作製に成功した。クライオ電顕を用いて、哺乳動物ミトコンドリアFoF1ATP合成酵素テトラマーの単粒子構造解析を共同研究により行なった結果、現在、全体では約６オングストーム、FoF1モノマーにフォーカスすると、3.6オングストローム分解能の構造を得ている。

在这项研究中，研究计划是为了稳定整个FOF1ATP合酶四聚体（四聚体），对全功能长度进行高分辨率的X射线晶体结构分析，并进一步分析使用冷冻电子显微镜（冷冻电子显微镜）的单粒子的静态结构（澄清的效果依赖于时间依赖于时间依赖的效果），以进行动态依赖于时间依赖的效果（动态）。澄清酶功能的详细机制。首先，我们进行了针对高分辨率结构分析样品制备的研究，结果，我们成功地纯化了酶单体，二聚体，四聚体和低聚物。此外，通过这种方法获得的酶能够通过优化溶液条件（未发表）来返回到线粒体内膜中存在的寡聚形式。这是世界上第一次，这种酶不再是低聚物，可以通过溶解在体外恢复为低聚物，并且证明纯化的酶是完整且稳定的。此外，申请人不仅从哺乳动物的牛建立了一种净化人类酶的方法。结果是京都大学作为物质专利提交的，并于2022年9月作为PCT提交。接下来，通过这种纯化方法获得的样品开始了冷冻电子显微镜观察。为了准备冷冻剂，有必要去除（溶液交换）在纯化过程中使用的蔗糖并将其集中。由于该酶不能与透析或浓缩膜一起使用，因此开发了另一种方法（未发表）并成功地制造了冰冻果。一项联合研究对使用冷冻电子显微镜的哺乳动物线粒体FOF1ATP合酶四聚体的单个颗粒结构进行了分析，表明该结构目前在集中在总计FOF1单体上时具有3.6 Angstrom分辨率。