ウシ心筋ＦｏＦ１ＡＴＰ合成酵素の機能する完全複合体の構造解析

牛心脏FoF1ATP合酶功能完整复合物的结构分析

• 批准号: 13J05370
• 负责人: 慈幸 千真理
• 金额: $ 1.53万
• 依托单位: Osaka University (2014-2017)University of Hyogo (2013)
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• 财政年份: 2013
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2013-04-01 至 2018-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-13J05370/
• 关键词: 哺乳動物; 膜蛋白質複合体; 三次元結晶化; 膜蛋白質; 三次元結晶; 電子顕微鏡観察

FoF1ATP合成酵素の全体構造は非常に不安定なため50年以上にわたる構造研究によっても高分解能で決定されておらず、その反応機構の解明が困難に陥っている。申請者は、人工的な脂質二重膜に再構成させ本酵素を安定化させる二次元結晶化により、世界で初めて脂質二重膜に埋まったその全長の構造解析に成功したが（Jiko et al., eLife, 2015）、分解能が24オングストロームと充分でなかったために反応メカニズムの解明には至らなかった。また、精製過程でイオン交換クロマトグラフィを使用することで膜間ドメインから解離を始めることが我々の単粒子構造解析によって明らかになり、精製された試料の均一性が低いことがわかった。この結果をもとに申請者は、これまで蛋白質に負荷のかからない密度勾配遠心分離法による精製方法の開発に専念し、非常に安定で無傷な本酵素を精製することに成功した。この精製方法で得られたサンプルに対し予備的なクライオ電子顕微鏡顕観察を行ったところ、完全な本酵素の均一な像を確認でき、クライオ電子顕微鏡による高分解能単粒子解析に値する試料調整が可能であることが判明した。本研究では、全体酵素の大量調整を行い、共同研究による単粒子構造解析と申請者自身による三次元結晶化・X線結晶構造解析によりFoF1ATP合成酵素の完全な構造を高分解能で決定し、哺乳動物のプロトン駆動ATP合成過程の全容を解明することを目指している。

The overall structure of FoF1ATP synthase is very unstable and has been studied for more than 50 years. It is difficult to understand the determination of high resolution energy and the reaction mechanism of high resolution. The applicant has reconstructed the artificial lipid double membrane and reconstructed the enzyme, stabilized it and crystallized it into two dimensions, and the world's first lipid double membrane has been successfully analyzed for its full-length structure (Jiko et al. al., eLife, 2015), decomposition energy が24オングストロームとfull でなかったために inverse 応メカニズムの解明には to らなかった. The purification process is as follows: The particle structure analysis of the single particle structure is done, and the homogeneity of the refined sample is low and low.このRESULTSをもとにApplicantは、これまでproteinにloadのかからないDensity matching telecentric separation methodにThe purification method of the enzyme is very stable and harmless, and the enzyme is refined successfully. The purification method is based on the pre-prepared electronic microscopic microscope and the homogenization of the original enzyme. It is possible to confirm the image and confirm the electron microscope, and to analyze the single particles with high resolving energy, and to adjust the sample, and to make it clear. This research is based on extensive adjustments to all enzymes and joint research on single particle structure analysis and the applicant's own three-dimensional crystallization and X-ray crystal structure analysis The complete structure and high catalytic energy of oF1ATP synthase are determined, and the ATP synthesis process of mammals is fully understood and explained.

项目成果

Electron crystallography of tomographic volumes.

断层扫描体积的电子晶体学。

• 发表时间: 2016
• 作者: Kazutoshi Tani;Karen Davies;Chimari Jiko;Shintaro Maeda;Kyoko Shinzawa-Itoh;Deryck Mills;Tomitake Tsukihara;Yoshinori Fujiyoshi;Werner Kuhlbrandt;Christoph Gerle
• 通讯作者: Christoph Gerle