Mapping synaptic cleft proteomes by photoactivated proximity labeling

通过光激活邻近标记绘制突触裂隙蛋白质组

• 批准号: 22KJ1743
• 负责人: 高遠 美貴子
• 金额: $ 1.41万
• 依托单位: Kyoto University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• 财政年份: 2023
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2023-03-08 至 2024-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-22KJ1743/
• 关键词: 近傍ラベル化法; タンパク質間相互作用; インタラクトーム; プロテオミクス; 神経伝達物質受容体

近傍ラベル化法とは、生体内環境で特定のタンパク質の周辺に存在するタンパク質を網羅的にラベル化し同定する方法である。近傍ラベル化法は未知のタンパク質間相互作用を同定する上で有用であるが、従来法は標的タンパク質に外因性酵素を遺伝子工学的に融合する必要があるため、本来のタンパク質の動態を反映しない可能性がある。そこで当研究室は遺伝子改変を必要としない光駆動の近傍ラベル化法を開発した。本手法では、標的タンパク質に小分子の光増感剤を化学修飾し、光照射によって一重項酸素を発生させることで周辺タンパク質を酸化、ラベル化する。本研究ではこの光駆動近傍ラベル化法を用いて、生きたマウス脳内に発現する神経伝達物質受容体の新規相互作用分子候補を発見することを目的とする。具体的には学習や記憶形成において重要な役割を果たすAMPA型グルタミン酸受容体や抑制性神経伝達を担うGABAA受容体などの相互作用分子を同定することを目指す。令和3年度は各標的受容体に光増感剤を修飾する化合物を合成し、実際に生きたマウス脳内で光駆動近傍ラベル化法の実験系を確立した。質量分析の結果、標的受容体との相互作用が知られているタンパク質やシナプス間隙タンパク質が複数同定され、光駆動近傍ラベル化法がin vivo適用可能であることを示した。今後は同定された個々のタンパク質と標的受容体との関係性をイメージング等の手法を用いて調査する。また、本手法を用いてAMPA型グルタミン酸受容体周辺プロテオームの時間変化を追跡することも試みる。

近标记是一种在特定蛋白质周围的体内环境中全面标记和鉴定蛋白质的方法。近标记的方法可用于识别未知的蛋白质 - 蛋白质相互作用，但是常规方法需要对外源性酶进行基因工程融合以靶向蛋白质，并且可能无法反映原始蛋白质的动力学。因此，我们的实验室开发了一种轻驱动的近标记方法，不需要遗传修饰。在此技术中，靶蛋白通过小分子光敏剂化学修饰，并且周围蛋白被光照射通过产生单线氧氧化和标记。这项研究旨在发现使用这种光驱动的近标记方法在活小鼠大脑中表达的神经递质受体的新型潜在相互作用分子。具体而言，我们旨在鉴定相互作用的分子，例如AMPA型谷氨酸受体，这些分子在学习和记忆形成中起着重要作用，以及在抑制神经传递中起重要作用的GABAA受体。在2021年，将修饰光敏剂的化合物合成到每个靶基受体中，并在活小鼠的大脑中建立了用于轻驱动近型标记的实验系统。质量分析表明，已知与靶受体相互作用的多种蛋白质和突触狭缝蛋白，表明光驱动的近标记方法适用于体内。将来，将使用成像等技术研究确定的单个蛋白质与靶受体之间的关系。我们还尝试使用该技术跟踪AMPA型谷氨酸受体周围蛋白质组织的时间变化。

项目成果

Mapping a glutamate receptor interactome in living mice by photoactivated proximity labeling

通过光激活邻近标记绘制活体小鼠谷氨酸受体相互作用组图

• 发表时间: 2022
• 作者: Mikiko Takato;Hayata Utsunomiya;Tomonori Tamura;Itaru Hamachi
• 通讯作者: Itaru Hamachi