キナーゼ基質網羅的同定とゲノム変異依存的リン酸化シグナル解析

激酶底物的全面鉴定和基因组突变依赖性磷酸化信号的分析

基本信息

批准号：
21J15068
负责人：
新苗智也
金额：
$ 0.96万
依托单位：
Kyoto University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2021
资助国家：
日本
起止时间：
2021-04-28 至 2023-03-31
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-21J15068/
关键词：
プロテオミクスキナーゼホスファターゼ

项目摘要

今年度は、新規キナーゼ基質網羅的同定法およびチロシンホスファターゼの包括的活性測定法の確立を目指した。新規キナーゼ基質網羅的同定法に関しては、近接依存性ビオチン標識、キナーゼ摂動リン酸化プロテオミクス、リン酸化モチーフ解析の3つのアプローチにより、CK2およびPKAの基質同定に成功した。また、同定された基質周辺でのがんに関連するアミノ酸変異の影響を評価し、発がん性変異がリン酸化シグナルに影響を与えうることを示した。チロシンホスファターゼの包括的活性測定法に関しては、チロシンホスファターゼ（PTP）と強く結合する非加水分解性のリン酸化チロシン模倣体（F2Pmp）を組み込んだペプチド型プローブに着目した。本研究では、配列を系統的にデザインした17種のF2Pmpペプチドプローブを合成した。これらプローブを用いることで、プローブ配列依存的にPTPと結合することを示したと共に、classical PTPの包括的濃縮を達成した。また、F2PmpプローブによるPTP濃縮の大規模情報を取得することにより、これまでは行えなかったPTPのpY基質指向性情報とF2PmpプローブによるPTP濃縮の相関の詳細な解析を可能とし、その相関を明らかにした。本研究により、F2Pmpプローブ配列の効率的な設計が可能になったと考えられる。さらに、本研究ではF2PmpプローブがPTP活性依存的にPTPと結合することを示し、本プローブを用いることにより、EGF刺激において、複数のPTPの活性が経時的に変動することを示した。これらの手法はリン酸化ネットワーク全体の理解に資する重要な基盤となると考えられる。

今年，我们旨在建立一种识别新型激酶底物的综合方法，以及一种测量酪氨酸磷酸酶活性的综合方法。关于新型激酶底物的全面鉴定，我们使用三种方法成功地鉴定了CK2和PKA的底物：接近依赖性生物素标记，激酶扰动磷酸化蛋白质组学和磷酸化基序分析。我们还评估了鉴定出的底物周围与癌症相关的氨基酸突变的影响，表明致癌突变会影响磷酸化信号。关于酪氨酸磷酸酶活性的综合测定，我们集中在肽型探针上，该探针结合了不可用的磷酸化磷酸化酪氨酸模仿（F2PMP），这些酪氨酸（F2PMP）与酪氨酸磷酸酶（PTP）强烈结合。在这项研究中，通过系统设计的序列合成了17个F2PMP肽探针。使用这些探针，它表明它以探针序列依赖性方式与PTP结合，并实现了经典PTP的全面富集。此外，通过使用F2PMP探测器获取有关PTP富集的大规模信息，我们使PY底物方向性信息在PTP和PTP富集之间使用F2PMP探针进行了详细的详细介绍，并且在以前无法执行和相关性。这项研究似乎已经实现了F2PMP探针序列的有效设计。此外，在这项研究中，我们表明F2PMP探针以PTP活性依赖性方式与PTP结合，并且通过使用此探针，在EGF刺激期间，多个PTP的活性随时间而变化。这些技术被认为是重要的基础，它将有助于理解整体磷酸化网络。