ジーンターゲティングによるコンタクチン遺伝子欠損マウスの作製と解析

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コンタクチンは免疫グロブリンスーパーファミリーに属する脳神経系特異的細胞接着分子であり、脳の発生と発達過程に密接な関わりを持つと考えられている。このコンタクチン遺伝子のノックアウトマウスの作製および解析が本研究のテーマである。まず、相同組換えを起こしたES細胞を選別するためにネオマイシン耐性遺伝子をコンタクチン遺伝子の第2エクソンにポジティブ選別用に挿入し、さらに非相同組替え体のネガティブ選別法としてジフテリアトキシン遺伝子を5'末端に付加した相同組換え用のベクターを構築した。ターゲティングベクターを電気穿孔法により、ES細胞内に導入し、in vitroでG418含有ES培地で培養し、肉眼でコロニーが確認できるようになった時点でG418耐性クローンと判断し単一コロニーごとに実体顕微鏡下で採取しクローニングを行ない、PCR用と培養用に分けて維持した。PCR用サンプルは、6クローンを1グループとして、第1回目のスクリーニングを行ない、陽性のグループより第2回目のシングルクローンのスクリーニングを行なった。ここで確認できた陽性クローンに対応する培養用のクローンを維持継代を続け、一部からDNAを抽出して最終的にサザンブロットによる確認を行ない、2クローンが相同遺伝子組換えをおこしたクローンであることを確認した。次に集合キメラ法によるキメラマウスの作製に移った。実体顕微鏡下でES細胞塊を選別し、細菌培養用のシャーレ内で、透明帯を除去しておいた2.5日胚を2個ずつES細胞塊と接着させ、一晩培養後、偽妊娠マウスの子宮壁の卵管に近い部分に胚を移植し、キメラマウスを得た。