Analysis of miRNA polygenic network on hybrid sterility locus by novel forward genetics

通过新型正向遗传学分析杂交不育位点上的 miRNA 多基因网络

• 批准号: 22KJ0365
• 负责人: 森本 健斗
• 金额: $ 1.98万
• 依托单位: University of Tsukuba
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• 财政年份: 2023
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2023-03-08 至 2024-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-22KJ0365/
• 关键词: ゲノム編集; 順遺伝学法; Mutagenesis; microRNA; 精子形成; 生殖隔離; 胚盤胞補完法; 減数分裂

本研究は、精子形成に必須のmiRNA(以後、C1-XmiRs)の特定とその制御メカニズムの解明を目指し、特定の染色体領域だけに二つ以上のIndel変異やStructural Variantsを同時的かつランダムに導入する新規手法を開発している。C1-XmiRsが存在するゲノム領域にランダムに変異を誘導するため、これまでに各C1-XmiRゲノム領域を標的とするsgRNAを発現する合計17種のドナーベクターを、ランダムな組み合わせで染色体に導入したES細胞を作製した。続けて、このES細胞にCas9ベクターをトランスフェクションし、C1-XmiRsゲノム領域に変異を誘導した単一細胞由来のESクローンをこれまでに87クローン得た。ドナーベクターライブラリーの導入効率および導入されたsgRNAの組合せを確認するために、これら87のESクローンにおいて多検体次世代シークエンス解析を行い、1～16種類(平均4.7種類)のsgRNAベクターが導入されていることが明らかになった。続いて、導入されたsgRNAとCas9によってIndel変異やStructural Variantsを導入できたか確認したところ、25～93％の標的C1-XmiRゲノム領域でIndel変異やStructural Variantsが導入されていることが確認できた。また、これらの変異は導入されたsgRNAの組み合わせから期待される変異と一致していた。以上の結果は、本手法が特定の染色体領域に多種多様な変異を同時的かつランダムに導入したことを明確に示す。精子形成に必須のC1-XmiRsの特定とその制御メカニズムの解明するため、これらのC1-XmiRsランダム変異をF0世代で迅速に解析できるキメラマウス作出法を確立した。現在、C1-XmiRsランダム変異ESクローンからキメラマウスを発生させ、順次表現型比較解析を実施している。

In this study, に and spermatogenesis に must be controlled by <s:1> miRNA(subsequent, C1-XmiRs) <s:1> specific とそ <s:1> to メカニズム clarify を the を target <s:1> and specific <s:1> chromosomal domain だけに with more than two <e:1> <s:1> Indel variations やStructural Variantsを at the same time, する ラ ラ ダムに ダムに import する new regulations approach を development て る る る. C1 - XmiRs が exist す る ゲ ノ ム field に ラ ン ダ ム に - induced different を す る た め, こ れ ま で に C1 - each XmiR ゲ ノ ム field を mark と す る sgRNA を 発 now す る total 17 の ド ナ ー ベ ク タ ー を, ラ ン ダ ム な group み close わ せ で chromosome に import し た ES cells を cropping し た. 続 け て, こ の ES cells に Cas9 ベ ク タ ー を ト ラ ン ス フ ェ ク シ ョ ン し, C1 - XmiRs ゲ ノ に ム field - induced different を し た 単 a cell origin の ES ク ロ ー ン を こ れ ま で に 87 ク ロ ー ン た. ド ナ ー ベ ク タ ー ラ イ ブ ラ リ ー の import working rate お よ び import さ れ た sgRNA の combination せ を confirm す る た め に, こ れ ら 87 の ES ク ロ ー ン に お い て 検 body next generation more シ ー ク エ ン ス parsing を い, 1 ~ 16 species (average 4.7 kinds) の sgRNA ベ ク タ ー が import さ れ て い る こ と が Ming ら か に な っ Youdaoplaceholder0. 続 い て, import さ れ た sgRNA と Cas9 に よ っ て Indel - different や Structural Variants を import で き た か confirm し た と こ ろ, 25 ~ 93% の mark C1 - XmiR ゲ ノ ム field で Indel - different や Structural Variantsが import されて る る とが とが confirm で た た. ま た, こ れ ら の - different は import さ れ た sgRNA の group み close わ せ か ら expect さ れ る - different と consistent し て い た. は の results above, this technique に が の chromosome specific field a variety of many others in な - different を simultaneous か つ ラ ン ダ ム に import し た こ と を に す indicated clearly. Spermatogenesis に must の C1 - XmiRs の specific と そ の suppression メ カ ニ ズ ム の interpret す る た め, こ れ ら の C1 - XmiRs ラ ン ダ ム - different を F0 generation で に quickly parsing で き る キ メ ラ マ ウ ス を make method to establish し た. Now, C1 - XmiRs ラ ン ダ ム - different ES ク ロ ー ン か ら キ メ ラ マ ウ ス を 発 raw さ せ, progressive phenotype comparison analytic を be applied し て い る.

项目成果

miRNA多重遺伝子ネットワークを明らかにするランダム変異ESライブラリーの構築

构建随机突变ES文库揭示miRNA多基因网络

• 发表时间: 2022
• 作者: 森本 健斗; 鈴木 颯;久野 朗広;大徳 陽子;谷本 陽子;加藤 花名子;村田 知弥;杉山 文博;水野 聖哉
• 通讯作者: 水野 聖哉

Construction of random mESC mutant library revealing polygenic miRNAs that regulate spermatogenesis.

随机 mESC 突变体文库的构建揭示了调节精子发生的多基因 miRNA。

• 发表时间: 2022
• 作者: 森本 健斗; 鈴木 颯;久野 朗広;大徳 陽子;谷本 陽子;加藤 花名子;村田 知弥;杉山 文博;水野 聖哉
• 通讯作者: 水野 聖哉

生殖隔離制御遺伝子座Hstx2上のMir465クラスター欠損による精子形成への影響の再確認

再次确认Mir465簇缺失对生殖隔离控制位点Hstx2对精子发生的影响

• 发表时间: 2022
• 作者: 森本 健斗;沼田 幸樹;大徳 陽子;濱田 優子;加藤 花名子;高橋 智;村田 知弥;水野 聖哉;杉山 文博
• 通讯作者: 杉山 文博