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Analysis of miRNA polygenic network on hybrid sterility locus by novel forward genetics

通过新型正向遗传学分析杂交不育位点上的 miRNA 多基因网络

基本信息

批准号：
22KJ0365
负责人：
森本健斗
金额：
$ 1.98万
依托单位：
University of Tsukuba
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2023
资助国家：
日本
起止时间：
2023-03-08 至 2024-03-31
项目状态：
已结题

项目摘要

本研究は、精子形成に必須のmiRNA(以後、C1-XmiRs)の特定とその制御メカニズムの解明を目指し、特定の染色体領域だけに二つ以上のIndel変異やStructural Variantsを同時的かつランダムに導入する新規手法を開発している。C1-XmiRsが存在するゲノム領域にランダムに変異を誘導するため、これまでに各C1-XmiRゲノム領域を標的とするsgRNAを発現する合計17種のドナーベクターを、ランダムな組み合わせで染色体に導入したES細胞を作製した。続けて、このES細胞にCas9ベクターをトランスフェクションし、C1-XmiRsゲノム領域に変異を誘導した単一細胞由来のESクローンをこれまでに87クローン得た。ドナーベクターライブラリーの導入効率および導入されたsgRNAの組合せを確認するために、これら87のESクローンにおいて多検体次世代シークエンス解析を行い、1～16種類(平均4.7種類)のsgRNAベクターが導入されていることが明らかになった。続いて、導入されたsgRNAとCas9によってIndel変異やStructural Variantsを導入できたか確認したところ、25～93％の標的C1-XmiRゲノム領域でIndel変異やStructural Variantsが導入されていることが確認できた。また、これらの変異は導入されたsgRNAの組み合わせから期待される変異と一致していた。以上の結果は、本手法が特定の染色体領域に多種多様な変異を同時的かつランダムに導入したことを明確に示す。精子形成に必須のC1-XmiRsの特定とその制御メカニズムの解明するため、これらのC1-XmiRsランダム変異をF0世代で迅速に解析できるキメラマウス作出法を確立した。現在、C1-XmiRsランダム変異ESクローンからキメラマウスを発生させ、順次表現型比較解析を実施している。

In this study, we developed a new approach for the simultaneous introduction of two or more Indel variants and Structural Variants into specific chromosome domains for the regulation of miRNA(later, C1-XmiRs) essential for spermatogenesis. C1-XmiRs exist in different domains and are induced by different genes. A total of 17 genes are expressed in different C1-XmiRs domains. In this case, the ES cells were isolated from Cas9 cells and the C1-XmiRs were isolated from the ES cells. The introduction efficiency and combination of sgRNA were confirmed in 87 cases, and the analysis of sgRNA of 1 - 16 species (average 4.7 species) was performed. 25~93% of the target C1-XmiRs were introduced into the domain of sgRNA and Cas9. In addition, there are differences in the composition of sgRNA. The above results clearly indicate that the method has a variety of differences in specific chromosome areas at the same time. C1-XmiRs are essential for spermatogenesis, and their specific control mechanisms are rapidly established. Now, C1-XmiRs can be used to generate and analyze sequential phenotypes.