新規CRISPR-Cas系酵素の構造解析および作動機構の解明

新型CRISPR-Cas系统酶的结构分析和作用机制阐明

• 批准号: 22KJ0608
• 负责人: 中川 綾哉
• 金额: $ 1.41万
• 依托单位: The University of Tokyo
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• 财政年份: 2023
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2023-03-08 至 2024-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-22KJ0608/
• 关键词: CRISPR-Cas; CRISPR-Cas system; RNA編集; cryo-EM

申請者は、小型RNA依存性RNAヌクレアーゼであるCas13bt3-crRNA 2者複合体構造、および、Cas13bt3-crRNA-target RNA 3者複合体構造をそれぞれX線結晶構造解析とクライオ電子顕微鏡を用いた単粒子解析という2つの異なる手法を用いて決定した。得られた構造情報から、Cas13bt3はHEPNと呼ばれるヌクレアーゼドメインが、大きく構造変化することによって標的RNAを認識していることがわかった。また、構造情報と動力学シミュレーションの結果を組み合わせることで、Cas13bt3はアクティブサイトループと命名した活性部位近傍に存在するループ構造が活性化に重要であることを明らかにした。これらの標的RNAの認識・切断機構はこれまでに報告されていたCas13aやCas13dの、HEPNドメインの活性部位自体が大きく構造変化をすることによって活性化する機構とは全く異なる機構であった。さらに、得られた構造に基づいた合理的な改変によって、野生型Cas13bt3と比較してよりRNA編集活性が向上した高活性変異体（enCas13bt3/miniCas13bt3）の開発に成功した。これらの変異体は、哺乳類細胞においても高い活性を示した。申請者はこれらの成果をまとめ、筆頭著者としてMolecular Cell誌に報告した。現在は、さらなる高活性変異体の作製に取り組むとともに、作製した変異体を用いて複数の遺伝性疾患の治療応用にむけて検証を行っている。

The applicant shall determine the structure of Cas13 bt3-crRNA-target RNA 3 complex by X-ray crystallographic analysis, electron microscopy and particle analysis. Cas13bt3 is a member of the HEPN family. The results of structural information and dynamics are grouped together, Cas13 bt3 is named, and the structure is activated near the active site. The target RNA recognition/cleavage mechanism is reported in Cas13a, Cas13d, HEPN, and the active site itself is structurally modified. The development of a highly active variant (enCas13 bt3/miniCas 13 bt3) was successful compared with wild-type Cas13bt3. The activity of these cells is very high. The applicant shall report the results and the author shall report the Molecular Cell Journal. Now, high activity allogeneic system is selected for use in the treatment of multiple genetic diseases.