代謝制御性アミノ酸シグナルによる選択的スプライシングを介した転写後調節機構の解明

インスリン受容体（IR）には選択的スプライシングによって産生されるIR-AとIR-Bが存在する。本研究では、IR 遺伝子をモデルとして、アミノ酸に応答して選択的スプライシングを制御する因子と、mRNA前駆体配列上にあるスプライシング制御配列の同定を行い、アミノ酸によるシグナルが選択的スプライシング制御を行う機構の解明を目的とした。IR RNA配列上にある制御配列の探索を行った結果、イントロン11の+267～+541塩基の領域が、アミノ酸欠乏時のIR-A型優位への変化に必要であることがわかった。予測プログラムを用いて結合する因子の候補を探索したところ、PTBP1の結合配列が存在することが明らかになった。そこでPTBP1をsiRNAによってノックダウンし、内在性IRの選択的スプライシングパターンを解析したところ、PTBP1はIRのIR-A型のスプライシングを誘導することが明らかとなった。さらに、PTBP1はオルニチンに特異的に結合するタンパク質であることをわれわれは見出している。以上のことから、オルニチンがPTBP1に結合することでｍRNA前駆体への結合が阻害され、選択的スプライシングの調節ができなくなる結果、IR-B型優位へと変化することが示唆された。アミノ酸欠乏・オルニチン添加培地で培養したラット肝癌由来H4IIE細胞におけるIRの選択的スプライシングの経時的変化を解析したところ、アミノ酸欠乏によってスプライシングパターンが変化する時間と、アミノ酸欠乏状態の細胞へのオルニチン添加によるスプライシングが変化する時間には差が見られた。この理由として、オルニチンが細胞に取り込まれるのに時間がかかる場合と、オルニチンが直接、PTBP1などのオルニチン結合タンパク質を介してIRのスプライシングを制御するのではなく、その代謝産物がIRのスプライシングを制御する場合とが考えられた。

インスリン受容体（IR）には選択的スプライシングによって産生されるIR-AとIR-Bが存在する。本研究では、IR 遺伝子をモデルとして、アミノ酸に応答して選択的スプライシングを制御する因子と、mRNA前駆体配列上にあるスプライシング制御配列の同定を行い、アミノ酸によるシグナルが選択的スプライシング制御を行う機構の解明を目的とした。IR RNA配列上にある制御配列の探索を行った結果、イントロン11の+267～+541塩基の領域が、アミノ酸欠乏時のIR-A型優位への変化に必要であることがわかった。予測プログラムを用いて結合する因子の候補を探索したところ、PTBP1の結合配列が存在することが明らかになった。そこでPTBP1をsiRNAによってノックダウンし、内在性IRの選択的スプライシングパターンを解析したところ、PTBP1はIRのIR-A型のスプライシングを誘導することが明らかとなった。さらに、PTBP1はオルニチンに特異的に結合するタンパク質であることをわれわれは見出している。以上のことから、オルニチンがPTBP1に結合することでｍRNA前駆体への結合が阻害され、選択的スプライシングの調節ができなくなる結果、IR-B型優位へと変化することが示唆された。アミノ酸欠乏・オルニチン添加培地で培養したラット肝癌由来H4IIE細胞におけるIRの選択的スプライシングの経時的変化を解析したところ、アミノ酸欠乏によってスプライシングパターンが変化する時間と、アミノ酸欠乏状態の細胞へのオルニチン添加によるスプライシングが変化する時間には差が見られた。この理由として、オルニチンが細胞に取り込まれるのに時間がかかる場合と、オルニチンが直接、PTBP1などのオルニチン結合タンパク質を介してIRのスプライシングを制御するのではなく、その代謝産物がIRのスプライシングを制御する場合とが考えられた。