ゲノムマイニングによる糸状菌由来ペプチド系天然物の開拓

通过基因组挖掘开发源自丝状真菌的肽类天然产物

• 批准号: 22K19095
• 负责人: 尾崎 太郎
• 金额: $ 4.16万
• 依托单位: Tohoku University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Challenging Research (Exploratory)
• 财政年份: 2022
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2022-06-30 至 2025-03-31
• 项目状态: 未结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-22K19095/
• 关键词: ペプチド; 生合成; 糸状菌

本研究課題では、糸状菌天然物の生合成研究で利用されている麹菌を宿主として、糸状菌由来の非リボソーム合成酵素(NRPS)遺伝子を発現し、新規ペプチド系天然物の獲得を試みる。従来は、標的とする生合成遺伝子をプラスミドDNAに連結してクローン化した後、麹菌に導入する方法を採用していた。しかし、20kbを超えるような長大なNRPS遺伝子の場合、遺伝子のクローン化や麹菌への導入の効率が低く、これらの点が研究の律速段階となると考えられた。そこで、2022年度は遺伝子導入の効率化を目的として、プラスミドの構築を省略してPCR等により調製したDNA断片を直接麹菌に導入して発現する方法の検討を進めた。すでに機能が判明しているテルペン合成酵素遺伝子やポリケチド合成酵素遺伝子を研究材料として本手法の適用可能性を検証した。プロモーターやターミネーター、標的遺伝子をPCRにより増幅し、麹菌の形質転換に用いた。この際、各断片には互いにオーバーラップする配列ができるようプライマーを設計し、各断片が持つ相同配列間で組換えが起きることを期待した。また、Cas9遺伝子やガイドRNA配列を搭載したゲノム編集プラスミドを同時に麹菌へ導入し、標的遺伝子座での相同組換えを誘発することを計画した。プロトプラスト-PEG法を用いて麹菌にDNAを導入した結果、期待通り形質転換体が得られた。各形質転換体を培養し、代謝物を分析した結果、導入した遺伝子に由来する化合物の生産が確認できたことから、本手法により生合成遺伝子の導入と機能的な発現が可能であることが示された。生産が確認できた条件を基に導入する断片数や断片間のオーバーラップ長が形質転換効率に与える影響を調査し、NRPS遺伝子導入のための条件を設定した。

This study aims to explore the biosynthetic process of natural products from Aspergillus spp., to develop NRPS gene from Aspergillus spp., and to explore new ways to obtain natural products from Aspergillus spp. In the future, the method of DNA linkage, transformation and Aspergillus introduction will be adopted to synthesize genes. The introduction rate of NRPS gene is low, and the research speed of NRPS gene is low. In 2022, the efficiency of gene introduction, the construction of gene expression system, the elimination of PCR, the modulation of DNA fragments, and the direct introduction of bacteria were discussed. The function of this method is to identify and evaluate the feasibility of this method. The PCR amplification of the target gene and the qualitative transformation of Aspergillus spp. At the same time, each fragment is arranged in the same way, and each fragment is arranged in the same way The Cas9 gene was introduced into the genome and the same sequence was induced into the genome. The results of DNA introduction by PEG-based method are expected to be obtained through morphological transformation. The results of the culture of each substance, the analysis of metabolites, the confirmation of the production of the compound from which the gene was introduced, and the possibility of the discovery of the function of the gene from which the gene was introduced by this method were shown. The production confirmation conditions are based on the number of fragments introduced, the length of fragments introduced, the effect of physical transformation investigated, and the conditions for NRPS gene introduction set.