Development of a cellular analysis technology based on conditional IEDDA reactions

基于条件IEDDA反应的细胞分析技术的开发

基本信息

批准号：
22K19096
负责人：
水上進
金额：
$ 4.16万
依托单位：
Tohoku University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Challenging Research (Exploratory)
财政年份：
2022
资助国家：
日本
起止时间：
2022-06-30 至 2024-03-31
项目状态：
已结题

项目摘要

Tetrazine（Tz）とtrans-Cyclooctene（TCO）が共有結合を形成する逆電子需要型Diels-Alder（IEDDA）反応は、無触媒かつ圧倒的な速さで進行することから、様々な分野での応用が期待されているクリック反応の一つである。我々はこれまでに、大環状構造を持つtetrazineの構造を外部刺激で開環させることでIEDDA反応の進行を制御するシステムを開発したことから、本研究では新たに、光照射に応答してIEDDA反応が進行する反応モジュールを開発し、この原理を細胞内蛋白質濃度の光制御に応用することを目的として、以下の(i)および(ii)の研究を並行して行った。(i) 光応答性IEDDA反応の開発まず、光に応答して切断されるニトロベラトリル基を有するリンカー化合物を合成した。続いて、このリンカーを用いてテトラジン化合物を架橋したケージド大環状Tzの合成を試みたが、大環状化反応が進行せず、リンカーの再設計を行い、現在合成の途中である。(ii) 細胞内蛋白質濃度の光制御技術の開発細胞内蛋白質を人工的に分解するシステムとして、ユビキチンリガーゼと低分子リガンドを利用したPROTACシステムが知られる。まず初めに、様々な標的蛋白質と融合させることが可能なタグ蛋白質の細胞内分解システムを構築する、タグ蛋白質としては大腸菌のジヒドロ葉酸還元酵素eDHFRを選択し、eDHFRのリガンドTMPとE3ユビキチンリガーゼ（CRBN)のリガンド pomalidomideを連結した二官能性化合物を合成した。いくつかのリンカーの長さの化合物を合成し、化合物添加によって細胞内のeDHFR融合蛋白質を分解できることを確認した。最終的には(i)の技術とは組み合わせて、光応答性蛋白質分解システムへと改変する。

反向电子需求的Diels-Alder（IEDDA）反应，其中四嗪（TZ）和反式环烯辛烯（TCO）形成共价键，是预期在各种领域中应用的点击反应之一，因为它们以倒数速度催化和进展。我们以前已经开发了一个系统，该系统通过用具有外部刺激的大环结构打开四嗪结构来控制IEDDA反应的进展。在这项研究中，我们开发了一个新的反应模块，其中IEDDA反应响应光照射而进行，并并行进行以下研究（i）和（ii），目的是将该原理应用于细胞内蛋白质浓度的光控制。（i）首先开发光反应的IEDDA反应，合成具有硝基ver骨基团的接头化合物，响应于光。随后，试图使用该连接器形成四嗪化合物，但大环反应未进行，并且接头重新设计，并且合成目前正在进行中。（ii）开发用于细胞内蛋白质浓度的光构造技术使用泛素连接酶和小分子配体的Protac系统被称为人为降低细胞内蛋白质的系统。首先，我们为TAG蛋白构建了一个可与各种靶蛋白融合的细胞内降解系统。作为TAG蛋白，选择了大肠杆菌的二氢叶酸还原酶EDHFR，并合成了二官能化合物，其中EDHFR的配体TMP和E3泛素蛋白 - CRBN的E3泛素蛋白酶（CRBN）的配体Pomalidomide链接。合成了几个接头长度的化合物，并确认该化合物的添加会降解细胞内EDHFR融合蛋白。最终，结合技术（i）结合使用，将其转化为光反应蛋白水解系统。