植物病原糸状菌に対する「RNA農薬」の技術的基盤の構築

植物病原真菌“RNA农药”技术基地建立

• 批准号: 22K19181
• 负责人: 中屋敷 均
• 金额: $ 4.16万
• 依托单位: Kobe University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Challenging Research (Exploratory)
• 财政年份: 2022
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2022-06-30 至 2025-03-31
• 项目状态: 未结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-22K19181/
• 关键词: いもち病菌; RNA; RNAi; マイコウイルス; 生物防除

本年度は、本実験計画にある「RNA農薬」の実現に必須であるマイコウイルスのクローニングおよびin vitro転写系の構築を行った。RNA農薬の土台となる因子の候補は、これまでにRNAのみで感染が起こると報告されているDiaporthe ambigua RNA virus1（DaRV1）と類縁のPyricularia oryzae umbra-like virus 1（PoUV1）と命名したウイルスである。PoUV1の5'RACEおよび3'RACEを行い末端配列を決定した後に全長cDNAをクローニングした。またこのcDNAにPCRを用いてT3およびT7プロモーター配列を付加してin vitroで二本鎖のウイルスRNAを合成できることを確認した。現在、このdsRNAをリポソーム、PEG等を用いて、菌糸や胞子に導入することを試みている。また、より簡易な方法としてPoOLV1のサテライトRNAを用いた「RNA農薬」の開発も試みており、二種のサテライトRNA（ARNA１およびARNA3）の全長cDNAのクローニングを試みている。ARNA1については、クローニングが済んでおり、PoUV1と同様にT7やT3プロモーターを付加してRNAの合成に成功した。ARNA3は過去にRNA-seqからインシリコで構築した配列に間違いがあることが判明し、現在これを再構築してクローニングを試みている。ARNA1に関しては配列内にモデル遺伝子であるGFPなどを組込み、実際に遺伝子サイレンシングを誘導できるか、そのためのコンストラクトを現在作成しているところである。

This year, the implementation of "RNA farming" in this project must be carried out in the construction of vitro-based systems. The candidate for the RNA gene is Diaporthe ambigua RNA virus1 (DaRV1) and Pyricaria oryzae umbra-like virus 1 (PoUV1). PoUV1 5'RACE and 3'RACE are aligned in the middle of the line and then the full-length cDNA is sequenced. The cDNA sequence was confirmed by PCR using T3 and T7 primers. Now, the dsRNA synthesis system, PEG, etc. are used, and the introduction of bacteria and spores is tried. A simple method for the development and application of PoOLV1 RNA is proposed, and the full-length cDNA of two kinds of RNA (ARNA1 and ARNA3) is developed. ARNA1, T7, T3, T7, T8, T7, T7, T8, T9, T9, T9, ARNA3 is a new RNA-seq architecture for ARNA3. ARNA1 is related to the distribution of the gene, GFP, group, and real gene, and the induction of the gene.