植物病原糸状菌に対する「RNA農薬」の技術的基盤の構築

植物病原真菌“RNA农药”技术基地建立

• 批准号: 22K19181
• 负责人: 中屋敷 均
• 金额: $ 4.16万
• 依托单位: Kobe University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Challenging Research (Exploratory)
• 财政年份: 2022
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2022-06-30 至 2025-03-31
• 项目状态: 未结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-22K19181/
• 关键词: いもち病菌; RNA; RNAi; マイコウイルス; 生物防除

本年度は、本実験計画にある「RNA農薬」の実現に必須であるマイコウイルスのクローニングおよびin vitro転写系の構築を行った。RNA農薬の土台となる因子の候補は、これまでにRNAのみで感染が起こると報告されているDiaporthe ambigua RNA virus1（DaRV1）と類縁のPyricularia oryzae umbra-like virus 1（PoUV1）と命名したウイルスである。PoUV1の5'RACEおよび3'RACEを行い末端配列を決定した後に全長cDNAをクローニングした。またこのcDNAにPCRを用いてT3およびT7プロモーター配列を付加してin vitroで二本鎖のウイルスRNAを合成できることを確認した。現在、このdsRNAをリポソーム、PEG等を用いて、菌糸や胞子に導入することを試みている。また、より簡易な方法としてPoOLV1のサテライトRNAを用いた「RNA農薬」の開発も試みており、二種のサテライトRNA（ARNA１およびARNA3）の全長cDNAのクローニングを試みている。ARNA1については、クローニングが済んでおり、PoUV1と同様にT7やT3プロモーターを付加してRNAの合成に成功した。ARNA3は過去にRNA-seqからインシリコで構築した配列に間違いがあることが判明し、現在これを再構築してクローニングを試みている。ARNA1に関しては配列内にモデル遺伝子であるGFPなどを組込み、実際に遺伝子サイレンシングを誘導できるか、そのためのコンストラクトを現在作成しているところである。

は this year, this be 験 project に あ る "RNA farming 薬 の must be presently に で あ る マ イ コ ウ イ ル ス の ク ロ ー ニ ン グ お よ び in vitro planning write line is の build を っ た. RNA farmers 薬 の TuTai と な る factor の backup は and こ れ ま で に RNA の み で infection が up こ る と report さ れ て い る Diaporthe virus1 ambigua RNA (DaRV1) と class try の Pyricularia oryzae umbra - like virus get 1 (PoUV1) と is named at たウ スである スである スである. PoUV1 の 5 'RACE お よ び 3' RACE を row い ends with column を decided し た に after full length cDNA を ク ロ ー ニ ン グ し た. PCR を use い ま た こ の cDNA に て T3 お よ び T7 has プ ロ モ ー タ ー match column を plus し て in vitro で 2 lock の ウ イ ル を ス RNA synthesis で き る こ と を confirm し た. Now, こ の dsRNA を リ ポ ソ ー ム, PEG を with い て si や, bacteria spore に import す る こ と を try み て い る. ま た, よ り simple な methods と し て PoOLV1 の サ テ ラ イ ト RNA を with い た "RNA farming 薬 の open 発 も try み て お り, two kinds of の サ テ ラ イ ト RNA (ARNA1 お よ び ARNA3) の full-length cDNA の ク ロ ー ニ ン グ を try み て い る. ARNA1 に つ い て は, ク ロ ー ニ ン グ が 済 ん で お り, PoUV1 と with others に T7 has や T3 プ ロ モ ー タ ー を plus し の て RNA synthesis に successful し た. ARNA3 は past に RNA - seq か ら イ ン シ リ コ で build し た match between column に violations い が あ る こ と が.at し, now こ れ を to construct し て ク ロ ー ニ ン グ を try み て い る. ARNA1 に masato し て は match column に モ デ ル posthumous son 伝 で あ る GFP な ど を group 込 み traces of the event, be に 伝 son サ イ レ ン シ ン グ を induced で き る か, そ の た め の コ ン ス ト ラ ク ト を now done し て い る と こ ろ で あ る.