Development of a parental CRISPR system for insect gene editing

开发用于昆虫基因编辑的亲本 CRISPR 系统

基本信息

批准号：
22K19179
负责人：
大門高明
金额：
$ 4.16万
依托单位：
Kyoto University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Challenging Research (Exploratory)
财政年份：
2022
资助国家：
日本
起止时间：
2022-06-30 至 2024-03-31
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-22K19179/
关键词：
ゲノム編集昆虫 CRISPR 節足動物

项目摘要

本課題は、成虫への注射によって昆虫のゲノム編集を可能とするparental CRISPR法の学理を構築し、この方法のさらなる効率の向上、多用途化、適用可能範囲の拡大を実現させることを目的とする。2022年度は、以下の研究項目を実施した。(1) 「難インジェクション昆虫」における実証試験：従来法（＝卵への注射）ではゲノム編集が著しく困難であった種において、DIPA-CRISPR法によるゲノム編集実証試験を行った。寄生蜂の１種ではゲノム編集個体を得ることができなかったが、カメムシ目の１種においては数%の効率でゲノム編集個体を得ることができた。(2) 適用可能範囲（種）の調査：これまでの研究において、多栄養室型の卵巣をもつ昆虫（ハエなど）ではDIPA-CRISPRがうまく働かなかった。そこで蚊についてもテストしたところ、数%の効率でゲノム編集個体を得ることができた。これによって、昆虫の卵巣の３タイプのすべて（無栄養室、端栄養室、多栄養室）において、DIPA-CRISPRが可能であることが判明した。ハエでうまくいかない理由は不明である。(3) best practice構築：産卵様式ごとの最適な注射タイミングについて検討した。少量の卵を毎日産み続けるタイプの複数種において、造卵を開始して間もない新成虫に注射すると効率が跳ね上がるという特徴が共通してみられ、このタイプにおいては効率を50%以上に向上させることができるようになった。(4)より高度なゲノム編集法の開発：遺伝子ノックインについて、供与するドナーDNA（ssODNなど）の配列長等について検討した。コクヌストモドキにおいて、遺伝子ノックイン個体は安定して得ることができているものの、効率の顕著な向上は見られず、今後の課題である。

这个目标是构建父母CRISPR方法的理论，该理论能够通过注射到成年人中进行昆虫基因组编辑，并实现效率，多功能性和扩大应用范围的进一步提高。在2022财年中，实施了以下研究项目：（1）使用DIPA-CRISPR方法进行了“困难注射昆虫”的示范测试：使用常规方法（=注射到鸡蛋中）对基因组进行编辑非常困难的物种中进行了基因组编辑示范测试。尽管一种寄生的蜜蜂无法获得基因组编辑的个体，但一种臭虫能够获得效率百分比的基因组编辑的个体。（2）研究适用范围（物种）：在先前的研究中，dipa-crispr在具有多饲养卵巢的昆虫（例如苍蝇）中效果不佳。然后，我们测试了蚊子，发现基因组编辑的个体的效率百分比为几百分。这表明在所有三种类型的昆虫卵巢（非营养，内养和多核）中，dipa-Crispr均可使用。目前尚不清楚为什么它不适应苍蝇。（3）最佳实践结构：我们研究了每种卵形样式的最佳注入时间。在每天继续产卵的多种卵中，共同的特征是，将它们注入刚刚开始制作鸡蛋的新成年人时，它们会提高效率，而这种类型的效率现在已经能够提高效率超过50％。（4）开发更先进的基因组编辑方法：对于基因敲门，我们研究了供体DNA（Ssodn等）等的序列长度。尽管在鼻窦血小板中可以稳定地获得基因敲击个体，但尚未观察到效率的显着提高，这是未来的挑战。