カイコの異所発現トラップ法の開発

本年度は,カイコの異所発現トラップ法の展開に必要な系統の準備を進め,遺伝学的スクリーニングの準備を完了した.交配に必要な系統,すなわち,ミューテーター系統(ジーンサーチ系統;UAS配列をpiggyBacベクターの両端に持つ)・ジャンプスターター系統(piggyBac transposaseを高発現する)について,Inverse-PCR法によりベクター挿入部位を同定した.挿入部位の配列に基づいて,ベクターをホモに持つかヘテロに持つかをPCRで判別できるプライマーを設計した.そして,両系統のゲノムDNAを鋳型としてPCRによるジェノタイピングを行い,ホモ個体同士を交配しな.これによって,両系統についてベクターのホモ化を完了することができた.ミューテーター系統・ジャンプスターター系統ともに,トランスジェニックのマーカー遺伝子として蛍光タンパクを利用しているため(ミューテーター系統はactin3-EGFP,ジャンプスターター系統は3xP3-CFP),これまでは,トランスジェニック個体の同定には一個体ずつ蛍光顕微鏡を用いて蛍光タンパクの発現を観察する,という多大な労力を要していた.しかし,ベクターをホモ化したことで,蛍光顕微鏡を用いたジェノタイピングの必要が全く無くなり,大規模な遺伝学的スクリーニングの展開を現実的なものとすることができた.今後は,ミューテーター系統とジャンプスターター系統を交配してF1を得て,それにGAL4系統を交配して,新規変異体の獲得を行っていく.

本年度は,カイコの異所発現トラップ法の展開に必要な系統の準備を進め,遺伝学的スクリーニングの準備を完了した.交配に必要な系統,すなわち,ミューテーター系統(ジーンサーチ系統;UAS配列をpiggyBacベクターの両端に持つ)・ジャンプスターター系統(piggyBac transposaseを高発現する)について,Inverse-PCR法によりベクター挿入部位を同定した.挿入部位の配列に基づいて,ベクターをホモに持つかヘテロに持つかをPCRで判別できるプライマーを設計した.そして,両系統のゲノムDNAを鋳型としてPCRによるジェノタイピングを行い,ホモ個体同士を交配しな.これによって,両系統についてベクターのホモ化を完了することができた.ミューテーター系統・ジャンプスターター系統ともに,トランスジェニックのマーカー遺伝子として蛍光タンパクを利用しているため(ミューテーター系統はactin3-EGFP,ジャンプスターター系統は3xP3-CFP),これまでは,トランスジェニック個体の同定には一個体ずつ蛍光顕微鏡を用いて蛍光タンパクの発現を観察する,という多大な労力を要していた.しかし,ベクターをホモ化したことで,蛍光顕微鏡を用いたジェノタイピングの必要が全く無くなり,大規模な遺伝学的スクリーニングの展開を現実的なものとすることができた.今後は,ミューテーター系統とジャンプスターター系統を交配してF1を得て,それにGAL4系統を交配して,新規変異体の獲得を行っていく.