Investigation of ligands against an unique receptor expressing in avian oocytes and its physiological function

针对禽类卵母细胞中表达的独特受体的配体及其生理功能的研究

基本信息

批准号：
22K19244
负责人：
村井篤嗣
金额：
$ 4.08万
依托单位：
Nagoya University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Challenging Research (Exploratory)
财政年份：
2022
资助国家：
日本
起止时间：
2022-06-30 至 2024-03-31
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-22K19244/
关键词：
畜産学生理学ニワトリ卵栄養素脂質栄養

项目摘要

・産卵期のニワトリの卵母細胞膜で「低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質２ライク（LRP2L）」と仮称される機能未知の遺伝子が発現することを見つけ出した。本研究では、この受容体の生体内リガンドを同定することを目的とする。・ニワトリの卵母細胞に由来するcDNAを鋳型として、膜貫通領域を除いたLRP2L（翻訳開始点から31-2,120アミノ酸残基をコード）の遺伝子断片をPCRで増幅した。増幅した遺伝子断片は哺乳類細胞用発現ベクターに連結し、分泌型LRP2L発現ベクターを構築した。・哺乳類細胞を用いて、分泌型LRP2Lを培地中に放出させて、その培地からLRP2Lを精製した。その結果、分子サイズ約300 kDa前後に明瞭な単一のバンドが検出された。以上から、分泌型LRP2Lは予想通りのサイズで作出できたと判断した。・作出した分泌型LRP2Lをウサギに免疫し、リガンド結合部位に対する特異抗体を作出した。この抗体は、LRP2Lと特異的に結合することを確認した。今後、この抗体を利用してLRP2L受容体と候補リガンドとの結合を阻害することが出来るかを調査する。・作出したLRP2Lは予定通りのサイズで産生されるものの、分子サイズが巨大であるため、産生量が少ないことが判明した。そこで、分泌型LRP2L発現ベクターを鋳型として、4つの異なる分子サイズの分泌型ミニLRP2Lを作出した。そのうちの1つは培地への分泌量が高く、大量精製が可能となった。一連の成果により、LRP2Lのリガンド探索に活用できる組換えタンパク質を得ることができた。

- 我们发现，在产卵季节，在鸡的卵母细胞膜中表达了一个未知的功能基因，被暂定称为“低密度脂蛋白受体相关蛋白2类（LRP2L）”。这项研究旨在鉴定该受体的体内配体。 - 使用源自鸡卵母细胞作为模板的cDNA，通过PCR扩大了LRP2L的基因片段（从翻译起始点编码的氨基酸残基编码31-2,120氨基酸残基）。将扩增的基因片段连接到表达载体，以构建分泌的LRP2L表达载体。 - 分泌LRP2L使用哺乳动物细胞释放到培养基中，并从培养基中纯化LRP2L。结果，围绕约300 kDa的分子大小检测到一个独特的单个条带。从上面的情况下，确定分泌的LRP2L是在预期的大小下生产的。 - 用产生的分泌的LRP2L免疫兔子，并对配体结合位点产生特异性抗体。该抗体被证实与LRP2L特异性结合。将来，我们将研究该抗体是否可以用于抑制LRP2L受体和候选配体的结合。 - 生产的LRP2L的生产是按计划的大小生产的，但是由于分子大小较大，因此发现生产较低。因此，使用分泌的LRP2L表达载体作为模板产生了四个不同分子大小的分泌的小型LRP2L。其中之一被分泌到中等的中，可以进行大量的纯化。这一系列结果使我们获得了可用于寻找LRP2L配体的重组蛋白。