Investigation of ligands against an unique receptor expressing in avian oocytes and its physiological function

・産卵期のニワトリの卵母細胞膜で「低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質２ライク（LRP2L）」と仮称される機能未知の遺伝子が発現することを見つけ出した。本研究では、この受容体の生体内リガンドを同定することを目的とする。・ニワトリの卵母細胞に由来するcDNAを鋳型として、膜貫通領域を除いたLRP2L（翻訳開始点から31-2,120アミノ酸残基をコード）の遺伝子断片をPCRで増幅した。増幅した遺伝子断片は哺乳類細胞用発現ベクターに連結し、分泌型LRP2L発現ベクターを構築した。・哺乳類細胞を用いて、分泌型LRP2Lを培地中に放出させて、その培地からLRP2Lを精製した。その結果、分子サイズ約300 kDa前後に明瞭な単一のバンドが検出された。以上から、分泌型LRP2Lは予想通りのサイズで作出できたと判断した。・作出した分泌型LRP2Lをウサギに免疫し、リガンド結合部位に対する特異抗体を作出した。この抗体は、LRP2Lと特異的に結合することを確認した。今後、この抗体を利用してLRP2L受容体と候補リガンドとの結合を阻害することが出来るかを調査する。・作出したLRP2Lは予定通りのサイズで産生されるものの、分子サイズが巨大であるため、産生量が少ないことが判明した。そこで、分泌型LRP2L発現ベクターを鋳型として、4つの異なる分子サイズの分泌型ミニLRP2Lを作出した。そのうちの1つは培地への分泌量が高く、大量精製が可能となった。一連の成果により、LRP2Lのリガンド探索に活用できる組換えタンパク質を得ることができた。

・産卵期のニワトリの卵母細胞膜で「低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質２ライク（LRP2L）」と仮称される機能未知の遺伝子が発現することを見つけ出した。本研究では、この受容体の生体内リガンドを同定することを目的とする。・ニワトリの卵母細胞に由来するcDNAを鋳型として、膜貫通領域を除いたLRP2L（翻訳開始点から31-2,120アミノ酸残基をコード）の遺伝子断片をPCRで増幅した。増幅した遺伝子断片は哺乳類細胞用発現ベクターに連結し、分泌型LRP2L発現ベクターを構築した。・哺乳類細胞を用いて、分泌型LRP2Lを培地中に放出させて、その培地からLRP2Lを精製した。その結果、分子サイズ約300 kDa前後に明瞭な単一のバンドが検出された。以上から、分泌型LRP2Lは予想通りのサイズで作出できたと判断した。・作出した分泌型LRP2Lをウサギに免疫し、リガンド結合部位に対する特異抗体を作出した。この抗体は、LRP2Lと特異的に結合することを確認した。今後、この抗体を利用してLRP2L受容体と候補リガンドとの結合を阻害することが出来るかを調査する。・作出したLRP2Lは予定通りのサイズで産生されるものの、分子サイズが巨大であるため、産生量が少ないことが判明した。そこで、分泌型LRP2L発現ベクターを鋳型として、4つの異なる分子サイズの分泌型ミニLRP2Lを作出した。そのうちの1つは培地への分泌量が高く、大量精製が可能となった。一連の成果により、LRP2Lのリガンド探索に活用できる組換えタンパク質を得ることができた。