体細胞におけるコヒーシンの異所性発現による減数分裂模倣系の構築

通过体细胞粘连蛋白异位表达构建减数分裂模拟系统

• 批准号: 22K19248
• 负责人: 李 智博
• 金额: $ 4.08万
• 依托单位: Kobe University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Challenging Research (Exploratory)
• 财政年份: 2022
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2022-06-30 至 2024-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-22K19248/
• 关键词: 減数分裂; 生殖細胞; 配偶子; コヒーシン; 体細胞

本研究では，減数分裂特異的コヒーシンサブユニットの異所性発現により，体細胞において相同染色体の連結を促す減数分裂模倣系の構築を目的としている。そのため，Tet-Onシステムを利用して，市販のNIH3T3 Tet-On 3G Cell Lineに，Rad21L cDNAを挿入したpTRE3G-ZsGreen1ベクターを導入し，ドキシサイクリン(Dox)添加によるRAD21Lと緑色蛍光タンパク質(ZsGreen1)の発現誘導を行うことを試みた。しかし，上記のコンストラクトと薬剤耐性遺伝子を取り込ませて，ピューロマイシン存在化で形成された細胞コロニーを分離し薬剤誘導性のRAD21L発現細胞株を樹立する際に，細胞のコンタミがあったために，クローン細胞株としては樹立できていない。Doxの添加により，ZsGreen1とRAD21Lの発現が誘起されることは確認されているので，再度同じコンストラクトを用いて，クローン化された発現細胞株の樹立を試みる。REC8とRAD21Lに結合しているタンパク質を調べるために，本研究ではRad21L-3×FlagとRec8-3×Flagの２種類のノックインマウス（KI）を準備して，免疫沈降法と質量分析により相互作用タンパク質を同定することを試みており，結果も出始めている。それと並行して，減数分裂型コヒーシンサブユニットの生殖細胞における発現量はこれまで知られていなかったので，KIマウスの精巣抽出液を材料にFLAGタグに対する抗体でwestern blot法により両者の発現量を調べた。その結果，第一減数分裂前期の前半までは，RAD21LとREC8はほぼ等量発現しており，両方を合わせると，既報の体細胞のコヒーシンの発現量よりも一細胞当たりの発現量が多いことが明らかとなった。

The purpose of this study is to construct meiotic mimicry lines by linking identical chromosomes in somatic cells for meiosis specific heterosexual development. In the NIH 3T3 Tet-On 3G Cell Line, Rad 21L cDNA was introduced into pTRE3G-ZsGreen1, and RAD 21L and ZsGreen1 were added into Dox. In addition, when the RAD21L cell line was established, the cell culture was established. Dox was added to the culture medium, and the expression of ZsGreen1 and RAD21L was induced. In this study, Rad 21L-3×Flag and Rec8-3×Flag were prepared for mass spectrometry and mass spectrometry. In addition, the amount of meiotic sperm cells detected by western blot was also adjusted. As a result, in the first half of the first meiotic phase, RAD21L and REC8 were equally expressed, and the amount of somatic cells reported was increased.