Development of genetically modified mice (Osmonitoring mice) that monitor osmotic environment in the body for an understanding of immune regulation

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今年度は、①浸透圧モニタリングシステムの根幹をなす人工プロモーターの性質の解析と、②浸透圧モニタリングマウスの構築を行った。①浸透圧に感度良く応答し、DsRedを発現する独自の人工プロモーターを導入した細胞に対して、酸化ストレス、還元ストレス、一酸化窒素、炎症性ストレスなど浸透圧と異なるストレスを負荷したが蛍光強度の上昇は見られず、少なくとも試した刺激に対しては当該プロモーターが浸透圧特異性を持つことが明らかになった。また、複数作成した人工プロモーターのstable細胞をハイコンテント画像解析することで応答性の良い細胞株を単離することに成功した。さらに、単離した細胞株について共焦点レーザー顕微鏡を用いて24時間までタイムラプスを取得したところ、蛍光の発現は浸透圧刺激後約5時間程度から観察され20時間程度で安定することが明らかになった。浸透圧ストレスの程度に対する蛍光強度の変化も検討し（dose response）350 mOsmから450 mOsmまでは浸透圧強度に対応する蛍光強度が観察されることが明らかになった。②実際に人工プロモーターを導入したマウスを作成するために、polyA付加配列などを含む発現用DNA配列を大量に精製し、マウスの受精卵に導入した。数回のトライアルを経て、ゲノムに目的の配列が導入されたトランスジェニックマウスを1ライン取得することに成功した。このマウスについてwhole genome sequencingを行うことで、目的の人工プロモーターが13番染色体に2回直列につながった形で導入されていることを確かめた。しかしながら、このマウスから単離した腹腔マクロファージに対して浸透圧刺激をin vitroで行ってもDsRedの蛍光の増加を認めることができず、改めてトランスジェニックマウスを構築する必要性があると判断した。