廃水処理における除去メカニズム解明のためのウイルスの視覚的・特異的検出技術の開発

开发视觉和特异性病毒检测技术以阐明废水处理中的去除机制

基本信息

批准号：
22K18818
负责人：
久保田健吾
金额：
$ 4.08万
依托单位：
Tohoku University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Challenging Research (Exploratory)
财政年份：
2022
资助国家：
日本
起止时间：
2022-06-30 至 2024-03-31
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-22K18818/
关键词：
視覚的検出技術

项目摘要

電子顕微鏡で生物を可視化するための方法として、非特異的に生物を染色可能な方法を開発した。本手法は生物細胞に結合し、かつペルオキシダーゼ活性を有するヘミンとチラミドシグナル増幅法を組み合わせることで、任意の重元素による染色が可能な手法である。手法の開発にあたり、まず、ヘミン濃度、反応時間、チラミドシグナル増幅法の最適化を行った。最適化は、蛍光標識チラミドを用いて純粋培養株を標的として行った。蛍光強度を画像解析ソフトで定量的に測定し、各反応条件において高い蛍光強度が得られる条件を探索して、条件を決定した。その後、複合微生物生態系のモデルケースとして汚泥サンプル、またミネラルなどの無機物を多く含むモデルケースとして土壌サンプルに適用してその有用性を確認した。次に、細胞の金元素による標識を行った。具体的にはヘミンを生物細胞に結合させた後、チラミドシグナル増幅法でビオチンを沈着させた。そして金ナノ粒子結合ストレプトアビジンを反応させ、ビオチン-ストレプトアビジン結合により金ナノ粒子を細胞に結合させた。最後に金増感反応により金ナノ粒子を肥大化させ、それを走査型電子顕微鏡(SEM)で観察した。金シグナルを確認することができ、またSEM-EDXによる元素マッピングにおいて存在箇所を示すことができた。今後は本手法がウイルスの可視化に適用可能かを検討していく必要がある。またジゴキシゲニンを標識した長鎖遺伝子プローブの合成に関する検討を開始した。

已经开发了一种使用电子显微镜可视化生物的方法，该方法允许对生物体的非特异性染色。该技术是一种通过将HEMIN结合到生物细胞结合并具有过氧化物酶活性的HEMIN与Tyramide信号扩增方法结合并具有过氧化物酶活性的一种技术。在开发该方法时，进行了首先优化HEMIN浓度，反应时间和泰米酰胺信号扩增方法。使用荧光标记的泰米酰胺对纯培养物进行了优化。使用图像分析软件定量测量荧光强度，并搜索获得高荧光强度的条件，以找到每个反应条件，并确定条件。之后，将其应用于污泥样品，作为复杂微生物生态系统的模型案例，将土壤样品作为模型案例，其中包含大量矿物质和其他无机物质，以确认其效用。然后将细胞用金元素标记。具体而言，HEMIN与生物细胞结合，然后通过Tyramide信号扩增沉积生物素。然后对结合的金纳米颗粒结合的链霉亲和素反应，并通过生物素 - 链霉亲和素结合将金纳米颗粒与细胞结合。最后，金纳米颗粒通过金敏化反应扩大，并使用扫描电子显微镜（SEM）观察到这些反应。确认了金信号，并使用SEM-EDX显示了元素映射中的金信号。将来，我们需要考虑是否可以将此方法应用于病毒可视化。我们还开始研究用二高氧蛋白标记的长链基因探针的合成。