Identification of phosphorylation targets of zebrafish atypical protein kinase C using chemical genetics

研究了酶激酶的作用机理和功能特点，分析了直接磷酸化酶底物（Effektoren）的作用机理。本文对蛋白质荧光效应进行了初步研究。非典型型蛋白激酶C的effektorproteinder der atypischenproteinkinase C在hilife杂志上的“化学-遗传学”分析。Die verwendete Methode beruht prinzipiell darauf, Die Proteinkinase molecular biology so zu verändern, ass sie <e:1> ber eine zusätzliche Seitentasche innerhalb der ATP Bindungsstelle verf<e:1>, welche es ihr ermöglicht unförmige ATP- analoga wiz . b . N6-benzyl ATP während der Kinasereaktion umzusetzen （Liu et al., 1998; Hindley et al., 2004; Dephoure et al., 2005; Larochelle et al., 2005）。Der grosse Vorteil - dieser method light darin, ass in Kinasereaktionen von embryonischen Extrakten bei denen das ATP-Analog eingesetzh . d, ausschliesslich effektorprotein Der modifizierten“analogue -spezifischen”Kinase phosphoryliert werden, da unmodifizierte Kinasen das verwendete ATP-Analog verwenden können。Nachfolgend sollen效应蛋白mitels质谱法鉴定。这是一种体外激酶作用蛋白候选效应体。本文对斑马鱼异型蛋白激酶ciota（心脏和灵魂）蛋白进行了初步鉴定。斑马鱼Diese Kinase ist in whichtiger Regulator von epithelial - aler Zellpolarität （Yelon et al., 1999; horn - badovinac et al., 2001; horn - badovinac et al., 2003; Rohr et al., 2006; Rohr et al., 2008）。在“化学-遗传学”筛选中，“类似物-spezifischen”激酶在einem mehrzelligen Organismus durchgefhrt [j]]中得到了验证。

Die mechanistische und funktionale Charakterisierung einer jeden Kinase setzt voraus, dass direkte Phosphorylierungssubstrate (Effektoren) bekannt sind. Die Identifizierung solcher Effektorproteine stellt jedoch eine grosse experimentelle Herausforderung dar. In diesem Projekt soll versucht werden, Effektorproteine der atypischen Proteinkinase C mit Hilfe eines “chemisch-genetischen” Ansatzes zu finden. Die verwendete Methode beruht prinzipiell darauf, die Proteinkinase molekularbiologisch so zu verändern, dass sie über eine zusätzliche Seitentasche innerhalb der ATP Bindungsstelle verfügt, welche es ihr ermöglicht unförmige ATP-Analoga wie z.B. N6-benzyl ATP während der Kinasereaktion umzusetzen (Liu et al., 1998; Hindley et al., 2004; Dephoure et al., 2005; Larochelle et al., 2005). Der grosse Vorteil dieser Methode liegt darin, dass in Kinasereaktionen von embryonischen Extrakten bei denen das ATP-Analog eingesetzt wird, ausschliesslich Effektorproteine der modifizierten „analog-spezifischen“ Kinase phosphoryliert werden, da unmodifizierte Kinasen das verwendete ATP-Analog nicht verwenden können. Nachfolgend sollen Effektorproteine mittels massenspektrometrischer Verfahren identifiziert werden. Es ist ausserdem geplant, Kandidateneffektorproteine durch in vitro Kinasereaktionen zu testen. In diesem Projekt sollen Effektorproteine der Zebrafisch atypischen Proteinkinase C iota (Heart and soul) identifiziert werden. Diese Kinase ist ein wichtiger Regulator von epithelialer Zellpolarität im Zebrafisch (Yelon et al., 1999; Horne-Badovinac et al., 2001; Horne-Badovinac et al., 2003; Rohr et al., 2006; Rohr et al., 2008). Ein „chemisch-genetischer“ Screen mit einer „analog-spezifischen“ Kinase ist bislang noch nicht in einem mehrzelligen Organismus durchgeführt worden.