免疫系培養細胞を用いたセクリトーム解析による新規生物活性物質の網羅的探索

免疫系培養細胞に種々の合成化合物を添加した際に変化する培養上清中の分泌蛋白量を網羅的に解析することを目的としたセクリトーム解析の基礎検討を行った。免疫系培養細胞としてT細胞系培養細胞であるJurat細胞を用い、合成化合物としては先行研究で既にIL-2抑制効果を有することが判明している合成化合物（Bu-DIF-3など）を用いた。培養細胞を用いたセクリトーム解析を行う際は、培養液中のFBSを除去する必要があるが、通常、FBS freeの状態で細胞を長時間培養した場合、死細胞が増加してしまい培養液中に分泌された蛋白以外に細胞破壊に伴う漏出蛋白が出現してしまう。一方で、細胞生存率を確保するために、FBS freeでの培養時間を短縮した場合、分泌される蛋白量が不十分となり、質量分析装置の検出限界を下回ってしまう可能性がある。そこで我々は細胞生存率をある程度維持しながら分泌蛋白の量を確保できる条件を検討することにした。その結果、FBS freeの状態での培養時間が９時間の条件が最適であることを見出した。この条件で、IL-2抑制系の合成化合物を作用させて、セクリトーム解析を行ったところ、IL-2だけではなく、いくつかのサイトカイン蛋白の変動が確認できた。この基礎検討結果を踏まえて、本年度は培養細胞や合成化合物の種類を変化させて、新薬候補となる化合物のスクリーニングを行う予定である。また、既にIL-2抑制効果が判明している化合物について、細胞内シグナル経路に対する化合物の影響をウエスタンブロット法により確認したところ、シグナル経路内において合成化合物のターゲットを含む可能性が高い領域が判明した。さらに、レポーター遺伝子アッセイによりウエスタンブロット解析の結果の整合性を確認したところ、矛盾しないことが判明した。これを踏まえて本年度は、合成化合物のターゲット蛋白を特定したいと考える。

免疫系培養細胞に種々の合成化合物を添加した際に変化する培養上清中の分泌蛋白量を網羅的に解析することを目的としたセクリトーム解析の基礎検討を行った。免疫系培養細胞としてT細胞系培養細胞であるJurat細胞を用い、合成化合物としては先行研究で既にIL-2抑制効果を有することが判明している合成化合物（Bu-DIF-3など）を用いた。培養細胞を用いたセクリトーム解析を行う際は、培養液中のFBSを除去する必要があるが、通常、FBS freeの状態で細胞を長時間培養した場合、死細胞が増加してしまい培養液中に分泌された蛋白以外に細胞破壊に伴う漏出蛋白が出現してしまう。一方で、細胞生存率を確保するために、FBS freeでの培養時間を短縮した場合、分泌される蛋白量が不十分となり、質量分析装置の検出限界を下回ってしまう可能性がある。そこで我々は細胞生存率をある程度維持しながら分泌蛋白の量を確保できる条件を検討することにした。その結果、FBS freeの状態での培養時間が９時間の条件が最適であることを見出した。この条件で、IL-2抑制系の合成化合物を作用させて、セクリトーム解析を行ったところ、IL-2だけではなく、いくつかのサイトカイン蛋白の変動が確認できた。この基礎検討結果を踏まえて、本年度は培養細胞や合成化合物の種類を変化させて、新薬候補となる化合物のスクリーニングを行う予定である。また、既にIL-2抑制効果が判明している化合物について、細胞内シグナル経路に対する化合物の影響をウエスタンブロット法により確認したところ、シグナル経路内において合成化合物のターゲットを含む可能性が高い領域が判明した。さらに、レポーター遺伝子アッセイによりウエスタンブロット解析の結果の整合性を確認したところ、矛盾しないことが判明した。これを踏まえて本年度は、合成化合物のターゲット蛋白を特定したいと考える。