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新規な修飾構造を有する非ヘム鉄酵素ニトリルヒドラターゼの光応答と触媒機構の解明

阐明新型修饰结构的非血红素铁酶腈水合酶的光响应和催化机制

基本信息

批准号：
10129234
负责人：
遠藤勲
金额：
$ 1.22万
依托单位：
The Institute of Physical and Chemical Research
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas (A)
财政年份：
1998
资助国家：
日本
起止时间：
1998 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

ニトリルヒドラターゼ(NHase)は、システインスルフェン酸、システインスルフィン酸という翻訳後修飾を受けたCys残基を配位子とする新規な非ヘム鉄センターを活性中心とする。今年度は、以下の研究を行なった。(a)活性型酵素のX線結晶構造解析不活性型酵素の結晶構造解析に用いた結晶は、光照射を行っても容易には閏を放出して活性化しなかった。そこで、他のグループの条件に従い、PEGを沈殿剤として活性型酵素の結晶化を行った。その結果、22%PEG存在下で良質な結晶(結晶系C2,a=113.92,b=60.22,c=81.62)を得られた。この結晶では1.5Åまでの反射を得ることが出来た。現在、分子置換法を行い、データの解析を行っている。(b)翻訳後修飾の生成機構解析大腸菌で発現させた翻訳後修飾をもたないαサブユニットから再構成する系を確立した。再構成をAr雰囲気下で行なうと生成物は活性を示さず、大気にさらすと次第に活性を回復した。大気にさらす前後の複合体を精製し、質量分析を行なったところ、酵素活性の回復に伴ってαCys112が特異的にシステインスルフィン酸に酸化されることが明らかになった。(c)部位特異的突然変異体の解析不活性型の結晶構造を元に、光応答及び触媒反応に重要と思われるアミノ酸の置換体を作製し、置換の影響を検討した。今年度はαCys112,αCys114の修飾部位の酸素原子に水素結合している2つのArg残基(βArg56,βArg141)をGlu.Lys.Tyrに置換した変異体を作製した。Lys置換体のみ野生型の1-2%程度の活性を示した。また、βArg56Lys以外の変異体では野生型に見られるS→Feの電荷異動に由来する710nmの吸収が、650nmにシフトしていた。以上の結果は、βArg56,βArg141はいずれも非ヘム鉄の電子状態に重要な寄与をしており、触媒活性に必須であることを示している。(d)反応の遅い基質の検索時分割結晶構造解析に有利な基質検索し、isobutyronitrileはKi=5x10-6Mで競争阻害剤として作用し酵素と安定な複合体を形成することを見い出した。現在、結合様式の解析を行っている。

The ligands of the ligands of Cys residues have been modified. New regulations have not been detected. This year, the following studies will be conducted. (a) X-ray crystal analysis of active enzyme X-ray crystal analysis of inactive enzyme X-ray crystal analysis. The enzymatic activity of active enzyme was determined by the crystallization of the active enzyme. The results showed that the active enzyme was crystallized by the method of crystallization, and the conditions were determined by PEG. The results showed that in the presence of 22%PEG, the good results were obtained by using the crystal line C2Magneol 113.92, which is baccalaureate 60.22 menthol 81.62. The results show that the reflection is slightly higher than 1.5, and the reflection is not clear. At present, the molecular method is used to analyze the data. (B) after overhauling, the production machine analysis of bacteria shows that after overhauling, it is necessary to make sure that it is registered. It is then formed into Ar products that show the activity of the product and the activity of the product. Before and after the treatment, the complex was purified, the quantitative analysis was performed, and the enzyme activity was detected. The enzyme activity was detected with the specific enzyme of α-Cys112. (C) Analysis of the inactive crystal structure of the specific parts of the body, the response to light and the importance of the catalyst are important to determine the effect of acid on the body. In this year, the α-Cys112, α-Cys114 repair site was combined with β-Arg56 (β-Arg56, β-Arg141) and Glu.Lys.Tyr (β-Arg56, β-Arg141) to make the body of α-Arg56 and α-Arg141. Lys shows the activity of 1-2% of the wild type. In addition to β-Arg56Lys and β-Fe, the source of 710nm absorption and 650nm absorption is related to the wild type. The results of the above results, β-Arg56, β-Arg141, etc., are important to be sent to the consumer, and the activity of the catalyst must be checked. (d) reverse antisense Ki=5x10-6m antisense enzyme diazepam complex to form a complex of enzyme diazepam to form a complex of enzyme diazepam. Now, in combination with the method of parsing, the line data are analyzed.