タンパク質工学的手法による耐熱性D-アミノ酸脱水素酵素の創製と応用

利用蛋白质工程技术创建耐热D-氨基酸脱氢酶并应用

• 批准号: 13J04653
• 负责人: 秋田 紘長
• 金额: $ 0.64万
• 依托单位: Kyushu University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• 财政年份: 2013
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2013 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-13J04653/
• 关键词: D-アミノ酸脱水素酵素; D-アミノ酸; D-分岐鎖アミノ酸; 安定同位体標識D-アミノ酸; 結晶構造解析

近年の分析技術の飛躍的発展を受けて生体におけるD-アミノ酸の解析が進み、重要な生理的機能が明らかになってきた。それに伴い、抗生剤等の有用物質にD-アミノ酸が使用され始めている。D-アミノ酸は主に酵素合成法によって合成されており、現在までに数種の酵素合成法が工業化されている。しかしながら、これら既存の方法ではD-アミノ酸前駆体の合成が不可欠とされ、酵素の安定性が低いため生産効率が悪い。これらの問題点を解決するため、申請者は、好熱菌由来のNADP依存性meso-ジアミノヒメリン酸脱水素酵素(meso-DAPDH)に変異導入して、耐熱性NADP依存性D-アミノ酸脱水素酵素(D-AADH)を創製した。D-AADHは、熱安定的に光学不活性な2-オキソ酸から高純度のD-アミノ酸を一段階で合成可能なことから、非常に優れたD-アミノ酸合成酵素である。一方で、D-AADHは補酵素の利用がNADPに限定される。そこでNADはNADPよりも安価である点に着目し、D-アミノ酸の合成における有用性と効率の向上を目指し、非特異的な変異導入、三次元構造モデリング、結晶構造解析に基づく変異導入によりNAD依存性D-AADHの創製を行った。非特異的な変異導入と三次元構造モデリングに基づいたNAD依存性D-AADHの創製では、目的の変異酵素を取得できなかった。これらを踏まえ酵素の触媒機構の詳細な解明を進めるため、meso-DAPDH、NADP/meso-DAPDH複合体及びM DP/D-AADH複合体のX線結晶構造解析を行い、各々の構造解析に成功し、NADPの結合に関与するアミノ酸残基を明らかにした。安定同位体D-アミノ酸の酵素合成のモデル実験として、NADP依存性DAADHによるD-アミノ酸の合成反応、及びグルコース脱水素酵素によるNADPHの再生反応、この二酵素反応から成る生産システムを構築した。その結果、D-分岐鎖アミノ酸とその安定同位体標識体の酵素合成法を確立した。本酵素合成法で得られる安定同位体標識D-分岐鎖アミノ酸の収率と純度は、既報の酵素合成法と比べて最高の値を示した。

随着分析技术的最新进展，对生物体中的D-氨基酸的分析已经发展，并且重要的生理功能变得清晰。结果，D-氨基酸开始被用作有用的物质，例如抗生素。 D-氨基酸主要是通过酶合成方法合成的，迄今为止，几种酶合成方法已被工业化。但是，这些现有的方法使得合成D-氨基酸前体至关重要，并且生产效率很差，因为该酶的稳定性较低。为了解决这些问题，申请人在NADP依赖性的中二氨基甲酸脱氢酶（Meso-DAPDH）中，通过突变创建了一个依赖于NADP NADP NADP NADP依赖的D-氨基酸脱氢酶（D-AADH）。 D-AADH是一种极为出色的D-氨基酸合酶，因为它能够从一步中从热稳定的光活性2-氧气中合成高纯度D-氨基酸。另一方面，将辅酶用于D-AADH仅限于NADP。因此，我们集中于以下事实：NAD比NADP便宜，旨在提高其在D-氨基酸合成中的有用性和效率，并通过基于晶体结构分析而通过非特异性诱变，三维结构建模和Mutagenesis创建NAD依赖性D-AADH。基于非特异性诱变和三维结构建模的NAD依赖性D-AADH的创建不允许获得感兴趣的突变酶。基于这些因素，为了进一步详细阐明酶的催化机制，进行了X射线晶体结构分析，进行了MESO-DAPDH，NADP/MESO-DAPDH复合物和MDP/D-AADH复合物，并进行了结构分析，以及涉及NADP的氨基酸残留物。作为稳定同位素D-氨基酸酶促合成的模型实验，我们构建了由两种酶反应组成的生产系统，包括通过NADP依赖性DAADH合成D-氨基酸和葡萄糖脱氢酶对NADPH的再生。结果，建立了用于D支线链氨基酸及其稳定同位素标签的酶促合成方法。与先前报道的酶合成方法相比，通过该酶合成方法获得的稳定同位素标记的D支三支链氨基酸的产量和纯度最高。

项目成果

耐熱性NADP依存性D-アミノ酸脱水素酵素の構造解析

热稳定性 NADP 依赖性 D-氨基酸脱氢酶的结构分析

• 发表时间: 2013
• 作者: Akita H;Suzuki H;Doi K;Ohshima T.;大島敏久・秋田紘長・鈴木宏和・土居克実;秋田紘長・鈴木宏和・土居克実・大島敏久;秋田紘長・土居克実・大島敏久・櫻庭春彦
• 通讯作者: 秋田紘長・土居克実・大島敏久・櫻庭春彦

Efficient synthesis and stable isotope-labeling of D-branched-chain amino acids using thermostable D-amino acid dehydrogenase

使用热稳定性 D-氨基酸脱氢酶高效合成和稳定同位素标记 D-支链氨基酸

• 发表时间: 2013
• 作者: Akita H;Suzuki H;Doi K;Ohshima T.;大島敏久・秋田紘長・鈴木宏和・土居克実;秋田紘長・鈴木宏和・土居克実・大島敏久
• 通讯作者: 秋田紘長・鈴木宏和・土居克実・大島敏久