タンパク質工学的手法による耐熱性D-アミノ酸脱水素酵素の創製と応用

利用蛋白质工程技术创建耐热D-氨基酸脱氢酶并应用

• 批准号: 13J04653
• 负责人: 秋田 紘長
• 金额: $ 0.64万
• 依托单位: Kyushu University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• 财政年份: 2013
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2013 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-13J04653/
• 关键词: D-アミノ酸脱水素酵素; D-アミノ酸; D-分岐鎖アミノ酸; 安定同位体標識D-アミノ酸; 結晶構造解析

近年の分析技術の飛躍的発展を受けて生体におけるD-アミノ酸の解析が進み、重要な生理的機能が明らかになってきた。それに伴い、抗生剤等の有用物質にD-アミノ酸が使用され始めている。D-アミノ酸は主に酵素合成法によって合成されており、現在までに数種の酵素合成法が工業化されている。しかしながら、これら既存の方法ではD-アミノ酸前駆体の合成が不可欠とされ、酵素の安定性が低いため生産効率が悪い。これらの問題点を解決するため、申請者は、好熱菌由来のNADP依存性meso-ジアミノヒメリン酸脱水素酵素(meso-DAPDH)に変異導入して、耐熱性NADP依存性D-アミノ酸脱水素酵素(D-AADH)を創製した。D-AADHは、熱安定的に光学不活性な2-オキソ酸から高純度のD-アミノ酸を一段階で合成可能なことから、非常に優れたD-アミノ酸合成酵素である。一方で、D-AADHは補酵素の利用がNADPに限定される。そこでNADはNADPよりも安価である点に着目し、D-アミノ酸の合成における有用性と効率の向上を目指し、非特異的な変異導入、三次元構造モデリング、結晶構造解析に基づく変異導入によりNAD依存性D-AADHの創製を行った。非特異的な変異導入と三次元構造モデリングに基づいたNAD依存性D-AADHの創製では、目的の変異酵素を取得できなかった。これらを踏まえ酵素の触媒機構の詳細な解明を進めるため、meso-DAPDH、NADP/meso-DAPDH複合体及びM DP/D-AADH複合体のX線結晶構造解析を行い、各々の構造解析に成功し、NADPの結合に関与するアミノ酸残基を明らかにした。安定同位体D-アミノ酸の酵素合成のモデル実験として、NADP依存性DAADHによるD-アミノ酸の合成反応、及びグルコース脱水素酵素によるNADPHの再生反応、この二酵素反応から成る生産システムを構築した。その結果、D-分岐鎖アミノ酸とその安定同位体標識体の酵素合成法を確立した。本酵素合成法で得られる安定同位体標識D-分岐鎖アミノ酸の収率と純度は、既報の酵素合成法と比べて最高の値を示した。

の analysis technology in recent years の leap 発 exhibition を by け て raw body に お け る D - ア ミ ノ acid の parsing が into み, important な physiological function が Ming ら か に な っ て き た. Youdaoplaceholder0 accompanied by それに, antibiotics and other <s:1> useful substances にD-ア ノ acid が uses され first めて る る る る る る る る. D - ア ミ ノ acid は main に enzyme synthesis に よ っ て synthetic さ れ て お り, now ま で に several の enzyme synthesis が industrialization さ れ て い る. し か し な が ら, こ れ ら existing の way で は D - ア ミ ノ 駆 body の before acid synthesis が not owe と さ れ, low enzyme の stability が い た め production rate of unseen が 悪 い. こ れ ら の problem point を す る た め, applicants は, hot bacteria origin の NADP dependency meso - ジ ア ミ ノ ヒ メ リ ン acid dehydration vegetable enzyme (meso - DAPDH) に - different import し て, heat resistance, NADP dependency D - ア ミ ノ acid dehydration vegetable enzyme (D - AADH) を created し た. D - AADH は, thermal stability and に optical active な 2 - オ キ ソ acid か ら high-purity の D - ア ミ ノ acid を a Duan Jie で synthesis may な こ と か ら, very に れ た D - ア ミ ノ acid synthesis enzyme で あ る. One side で, D-AADH enzyme <s:1> is restricted される by がNADPに. そ こ で NAD は NADP よ り も Ann 価 で あ る point に し, D - ア ミ の ノ acid synthesis に お け る usefulness と の sharper rate upward を refers し, nonspecific な - different import, the three dimensional structure モ デ リ ン グ, crystal structure analytic に づ く - different import に よ り NAD dependency D - AADH の created を line っ た. Of nonspecific な - different import と three yuan structure モ デ リ ン グ に base づ い た NAD dependency D - AADH の created で は, purpose の - isoenzymes を obtain で き な か っ た. Tread こ れ ら を ま の え enzyme catalytic institutions の detailed な interpret を into め る た め, meso - DAPDH, NADP/meso - DAPDH complex and び M DP/D - AADH complex analytical line を い の X-ray crystal structure, various 々 の tectonic analytical に し success, NADP の combining に masato and す る ア ミ ノ acid residues を Ming ら か に し た. Stable isotopic body D - ア ミ の ノ acid enzyme synthesis の モ デ ル be 験 と し て, NADP dependability DAADH に よ る D - ア ミ の ノ acid synthesis 応, and び グ ル コ ー ス dehydrated vegetable enzyme に よ る NADPH の regeneration 応, こ の two enzyme reverse 応 か ら る production シ ス テ ム を build し た. The results of そ そ, the d-discriminant lock ア, the ノ acid とそ, the <s:1> stable isosteric marker and the cytase synthesis method を confirmed that た た. This enzyme synthesis で ら れ る stability with a lock body logo in D - ア ミ ノ acid の と purity は 収 rate, both reported の enzyme synthesis と than べ て の highest numerical を shown し た.

项目成果

耐熱性NADP依存性D-アミノ酸脱水素酵素の構造解析

热稳定性 NADP 依赖性 D-氨基酸脱氢酶的结构分析

• 发表时间: 2013
• 作者: Akita H;Suzuki H;Doi K;Ohshima T.;大島敏久・秋田紘長・鈴木宏和・土居克実;秋田紘長・鈴木宏和・土居克実・大島敏久;秋田紘長・土居克実・大島敏久・櫻庭春彦
• 通讯作者: 秋田紘長・土居克実・大島敏久・櫻庭春彦

Efficient synthesis and stable isotope-labeling of D-branched-chain amino acids using thermostable D-amino acid dehydrogenase

使用热稳定性 D-氨基酸脱氢酶高效合成和稳定同位素标记 D-支链氨基酸

• 发表时间: 2013
• 作者: Akita H;Suzuki H;Doi K;Ohshima T.;大島敏久・秋田紘長・鈴木宏和・土居克実;秋田紘長・鈴木宏和・土居克実・大島敏久
• 通讯作者: 秋田紘長・鈴木宏和・土居克実・大島敏久

Thermostable NADP-dependent D-amino acid dehydrogenase: Creation from meso-diaminopimelate dehydrogenase by site-directed mutagenesis and application

热稳定性NADP依赖性D-氨基酸脱氢酶：通过定点诱变从内消旋二氨基庚二酸脱氢酶中产生并应用

• 发表时间: 2013
• 作者: 奥山勇治;池田翔平;米田武寛;伊佐佳織;酒井孝明;松本広重;T. Ohshima
• 通讯作者: T. Ohshima