細胞内におけるＳＯＤ１蛋白質の構造・運動性解析による神経変性疾患の発症機構の解明

通过分析细胞内SOD1蛋白的结构和运动性阐明神经退行性疾病的发病机制

• 批准号: 13J04532
• 负责人: 村山 秀平
• 金额: $ 1.41万
• 依托单位: Kyoto University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• 财政年份: 2013
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2013-04-26 至 2015-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-13J04532/
• 关键词: ジスルフィド結合; 酸化還元電位; 細胞内環境; 溶液ＮＭＲ法; ＳＯＤ１タンパク質; ｉｎ－ｃｅｌｌ ＮＭＲ法; 神経変性疾患

今年度は、SOD1を含め、多くのタンパク質の機能に関与しているジスルフィド結合に関して、細胞内における物性を評価する研究を行った。多くのタンパク質が、分子内あるいは分子間に、ジスルフィド結合を有している。これらタンパク質のジスルフィド結合は、多くの生命現象において、重要な役割を担っていることが知られている。本研究では、溶液NMR法により、細胞内におけるタンパク質分子内ジスルフィド結合の被還元速度の定量を行った。また、得られた結果より、細胞内の酸化還元電位を評価した。実験には、分子内にジスルフィド結合を持つタンパク質CskのSH2ドメインを用いた。細胞内にSH2ドメインを導入し、細胞内おいて還元される速度を定量することに成功した。また、細胞内の主要な還元剤であるグルタチオンの生合成を阻害することで、細胞内を酸化的な条件にし、同様の実験を行った結果、被還元速度の低下が確認できた。このことから、SH2ドメインのジスルフィド結合をプローブとして、細胞内の酸化還元状態の変化を検出できることが示された。さらに、試験管内での結果と比較することで、タンパク質分子内ジスルフィド結合をプローブとして、細胞内の酸化還元電位を評価することに成功した。得られた細胞内の酸化還元電位は、従来報告されていた値よりも、より還元的な値であった。これは、タンパク質の分子内ジスルフィド結合の物性が、細胞内環境の影響を受けることが原因と考えられる。特に、本研究の解析から、細胞内において、分子込み合い効果が大きく影響を与えていることが原因の一つであることが示唆された。現在、その成果を論文として発表するため投稿準備を行っている。

今年，我们进行了研究，以评估二硫键键的物理特性，这些硫化物键参与细胞中许多蛋白质（包括SOD1）的功能。许多蛋白质在分子之间或之间具有二硫键。已知这些蛋白质中的二硫键在许多生物学现象中起重要作用。在这项研究中，通过溶液NMR对细胞内蛋白质内二硫键的降低率进行了定量。此外，根据获得的结果，评估了细胞内的氧化 - 雷克斯电位。该实验使用了具有分子内二硫键的蛋白质CSK的SH2结构域。将SH2结构域引入细胞，并量化细胞内降低的速率。此外，通过抑制谷胱甘肽的生物合成，细胞内的主要还原剂，将细胞内条件放置在氧化条件下，并进行了类似的实验，并确认了还原率。这表明可以使用SH2域的二硫键作为探针来检测细胞内的氧化还原状态的变化。此外，通过将结果与体外结果进行比较，我们能够使用分子内二硫键作为探针成功评估细胞内氧化 - 雷克斯电位。细胞中所得的氧化还原潜力比以前报道的值更还原。这被认为是由于受细胞内环境影响的蛋白质内分子二硫键的物理特性所致。特别是，对这项研究的分析表明，原因之一是分子充血作用对细胞具有重大影响。目前，我们准备提交结果以作为论文发表。

项目成果

19F-NMR spectroscopy of proteins in mammalian cultured cells

哺乳动物培养细胞中蛋白质的 19F-NMR 光谱

• 发表时间: 2014
• 作者: Danielsson J;Inomata K;Murayama S;Tochio H;Lang L;Shirakawa M;Oliveberg M.;村山 秀平
• 通讯作者: 村山 秀平