脳スライス標本でのグルタミン酸可視化による単一シナプスの短期可塑性評価技術の開発

本年度の研究では神経ネットワーク内の個々のシナプスが有する短期可塑性の評価を可能とする技術の完成を目標とした。近年使用されるようになった遺伝子コード型のグルタミン酸プローブ（iGluSnFR）を用いた蛍光グルタミン酸イメージングを検討するため、子宮内電気穿孔法によってiGluSnFRをマウス脳に発現させた。脳スライス標本を作製して局在を観察したところ、神経細胞膜上にiGluSnFRが局在する様子が観察された。そこで電気刺激によってグルタミン酸の開口放出を惹起しながらiGluSnFRの蛍光をイメージングしたところ、放出されたグルタミン酸によって蛍光強度が増大する様子が観察された。続いてiGluSnFRのシナプスへの局在化を試みた。シナプス前終末の細胞膜上に多く存在することが知られるSyntaxin1AとiGluSnFRとの融合タンパク質（Syntaxin1A-iGluSnFR）を分散培養神経細胞に発現させたところ、軸索上に局在し、特にシナプスに集積することが見出された。Syntaxin1A-iGluSnFRを子宮内電気穿孔法によってマウス脳に発現させ、スライスを作製して局在を観察したところ、分散培養同様軸索上に局在する様子が観察された。そこでSyntaxin1A-iGluSnFRを発現した脳スライス標本においてグルタミン酸開口放出を電気刺激によって惹起しながら蛍光イメージングを行ったところ、放出されたグルタミン酸によって軸索上のSyntaxin1A-iGluSnFRに由来する蛍光が明るくなる様子が観察された。さらに連続した刺激に応じた蛍光強度変化を観察したところ、軸索上の位置によってプローブの蛍光強度変化の動態が異なっている様子が見出された。以上によって当初の計画通り脳スライス標本内においてシナプスが有するグルタミン酸開口放出の短期可塑性を評価する技術が確立された。

本年度の研究では神経ネットワーク内の個々のシナプスが有する短期可塑性の評価を可能とする技術の完成を目標とした。近年使用されるようになった遺伝子コード型のグルタミン酸プローブ（iGluSnFR）を用いた蛍光グルタミン酸イメージングを検討するため、子宮内電気穿孔法によってiGluSnFRをマウス脳に発現させた。脳スライス標本を作製して局在を観察したところ、神経細胞膜上にiGluSnFRが局在する様子が観察された。そこで電気刺激によってグルタミン酸の開口放出を惹起しながらiGluSnFRの蛍光をイメージングしたところ、放出されたグルタミン酸によって蛍光強度が増大する様子が観察された。続いてiGluSnFRのシナプスへの局在化を試みた。シナプス前終末の細胞膜上に多く存在することが知られるSyntaxin1AとiGluSnFRとの融合タンパク質（Syntaxin1A-iGluSnFR）を分散培養神経細胞に発現させたところ、軸索上に局在し、特にシナプスに集積することが見出された。Syntaxin1A-iGluSnFRを子宮内電気穿孔法によってマウス脳に発現させ、スライスを作製して局在を観察したところ、分散培養同様軸索上に局在する様子が観察された。そこでSyntaxin1A-iGluSnFRを発現した脳スライス標本においてグルタミン酸開口放出を電気刺激によって惹起しながら蛍光イメージングを行ったところ、放出されたグルタミン酸によって軸索上のSyntaxin1A-iGluSnFRに由来する蛍光が明るくなる様子が観察された。さらに連続した刺激に応じた蛍光強度変化を観察したところ、軸索上の位置によってプローブの蛍光強度変化の動態が異なっている様子が見出された。以上によって当初の計画通り脳スライス標本内においてシナプスが有するグルタミン酸開口放出の短期可塑性を評価する技術が確立された。