能動的ターゲッティングリガンドとしての特殊ペプチドの探索とナノ治療への展開

寻找作为主动靶向配体的特殊肽及其在纳米治疗中的应用

基本信息

批准号：
13J06119
负责人：
吉冨徹
金额：
$ 3万
依托单位：
The University of Tokyo
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2013
资助国家：
日本
起止时间：
2013-04-01 至 2016-03-31
项目状态：
已结题

项目摘要

近年、抗体医薬に代わる新しい創薬のターゲットとして、非天然アミノ酸を有するポリペプチド(特殊ポリペプチド)が注目を集めている。この特殊ポリペプチドは、天然のアミノ酸からなるペプチドと比較して、標的と強く結合できる、また生体内で分解されにくいといった特徴を有している。特殊ポリペプチドが注目される一つの理由として、抗体医薬は分子量が大きく細胞膜を透過しないのに対し、このポリペプチドは分子量が2kDa程度であり、細胞内で機能する可能性が高いことが挙げられる。しかしながら、膨大な数の特殊ポリペプチドの中から阻害活性を有し、かつ細胞膜透過性を有するペプチドを探し出すことは非常に困難であった。そこで、申請者は、ピコタイタープレートを用いた細胞膜透過性ペプチドの探索法を考案した。30万ウェル（直径30μm）の穴が空いたガラス製のピコタイタープレート内に、転写可能なDNAテンプレートが結合した直径20μmのシリカビーズと細胞を挿入し、そのウェル内で転写・翻訳を行うことで、膜透過性ペプチドを探索するという方法である。エマルジョンポリメラーゼ連鎖反応法によって、一つのビーズ上に、一種類のDNAテンプレート（約百万本）を結合させることができるため、本方法は、理論上、数万種類程度の細胞膜透過性ペプチドを一度に解析することができる。また、そのウェル内にあるビーズ上のDNA配列情報を、パイロシークエンス法によって読み取ることができるため、各ウェル内で翻訳された膜透過性ペプチドの配列を読み取ることができる。平成27年度は、前年度に得られた結果をベースに、ペプチドへの蛍光標識法の確立と膜透過性があるモデルペプチドを用いた実験コンセプトの検証までを行った。その結果は、膜透過性ペプチドが翻訳されたウェル内に存在する細胞が強い蛍光を示す傾向があることから、本デバイスが設計通りに機能することが示唆された。

近年来，含有非天然氨基酸（特殊多肽）的多肽一直引起人们的关注，因为药物发现的新靶标代替了抗体药物。与由天然存在的氨基酸组成的肽相比，这种特殊的多肽具有能够与靶标结合并在体内降解的可能性较小的特征。特殊多肽注意的原因之一是抗体药物具有较大的分子量，并且不会渗透到细胞膜，而这些多肽的分子量约为2KDA，这很可能在细胞中起作用。但是，很难找到具有抑制活性的肽，并且可以从大量特殊多肽中渗透到细胞膜。因此，申请人设计了一种使用皮皮特板搜索细胞膜渗透肽的方法。该方法涉及插入直径为20μm的二氧化硅珠和细胞，可转录DNA模板与玻璃皮质板结合到一个玻璃皮质板中，其孔的孔为300,000孔（直径30μm），并在孔中进行转录和翻译，以搜索可膜到膜的肽。由于一种DNA模板（约百万）可以通过乳液聚合酶链反应方法与一个珠子结合，因此该方法可以一次分析数以万计的细胞膜可渗透肽。此外，由于可以通过焦磷酸测序读取孔中珠的DNA序列信息，因此可以读取每个井中翻译的膜渗透肽的序列。在2015年，根据上一年获得的结果，我们建立了一种肽荧光标记的方法，并使用可渗透膜的模型肽验证了实验概念。结果表明，该设备的功能如设计的，就像孔可渗透肽所在的井中的细胞倾向于表现出强烈的荧光。