摂食・情動に関与する受容体（メラニン凝集ホルモン受容体）の活性化制御機構の解明

（Ⅰ）哺乳類MCHR1におけるGタンパク質選択機構の解明哺乳類メラニン凝集ホルモン受容体MCHR1において、細胞内第2、第3ループ領域に存在するアミノ酸6残基を置換したi2_6sub及びi3_6subはGi/o選択的に活性低下を示す。本年度は、免疫沈降法によりi2_6sub及びi3_6subがGi/oに対する親和性を低下しているかどうかを生化学的に解析した。そして、MCHR1-Gi/o間の安定的な免疫沈降条件を確立したが、再現性を得るのは困難であった。そこで、パーキンエルマー社のEnspire Label-freeを用いて、受容体発現細胞にMCHを添加した際のインピーダンスの変動を測定することで、各置換体のGタンパク質選択性を評価した。その結果、野生型MCHR1はGi/oに由来する初期の急速な上昇応答と、Gqに由来する遅延性の応答が認められた。一方、i2_6subとi3_6subは初期の上昇応答の低下を示し、Gi/o活性低下が認められた。また、論文投稿用に、これまでの実験データの再現性の確認や統計解析を行った。以上の結果をまとめた原著論文を自身で執筆し、Cellular Signaling誌（査読有り）に投稿・掲載された（Hamamoto et al., 2015）。（Ⅱ）MCHR1-RGS8のin vivo相互作用解析Gタンパク質調節（RGS8）タンパク質過剰発現マウスを作製し、現時点において、RGS8過剰発現マウスを2ライン確立した[他研究室との共同研究]。そして体重・摂食量測定及び種々の行動実験を実施した。野生型マウスと比較して、RGS8過剰発現マウスにおいて特徴的な行動が認められたため、現在再現性を確認中である。また、口腔への薬物投与実験から、RGS8過剰発現による特徴的な行動はMCHR1を介することが見出された。

（Ⅰ）哺乳類MCHR1におけるGタンパク質選択機構の解明哺乳類メラニン凝集ホルモン受容体MCHR1において、細胞内第2、第3ループ領域に存在するアミノ酸6残基を置換したi2_6sub及びi3_6subはGi/o選択的に活性低下を示す。本年度は、免疫沈降法によりi2_6sub及びi3_6subがGi/oに対する親和性を低下しているかどうかを生化学的に解析した。そして、MCHR1-Gi/o間の安定的な免疫沈降条件を確立したが、再現性を得るのは困難であった。そこで、パーキンエルマー社のEnspire Label-freeを用いて、受容体発現細胞にMCHを添加した際のインピーダンスの変動を測定することで、各置換体のGタンパク質選択性を評価した。その結果、野生型MCHR1はGi/oに由来する初期の急速な上昇応答と、Gqに由来する遅延性の応答が認められた。一方、i2_6subとi3_6subは初期の上昇応答の低下を示し、Gi/o活性低下が認められた。また、論文投稿用に、これまでの実験データの再現性の確認や統計解析を行った。以上の結果をまとめた原著論文を自身で執筆し、Cellular Signaling誌（査読有り）に投稿・掲載された（Hamamoto et al., 2015）。（Ⅱ）MCHR1-RGS8のin vivo相互作用解析Gタンパク質調節（RGS8）タンパク質過剰発現マウスを作製し、現時点において、RGS8過剰発現マウスを2ライン確立した[他研究室との共同研究]。そして体重・摂食量測定及び種々の行動実験を実施した。野生型マウスと比較して、RGS8過剰発現マウスにおいて特徴的な行動が認められたため、現在再現性を確認中である。また、口腔への薬物投与実験から、RGS8過剰発現による特徴的な行動はMCHR1を介することが見出された。