コフィリンが飽和結合したアクチン繊維の分子間相互作用を近原子分解能で解き明かす

以近原子分辨率阐明肌动蛋白纤维与饱和丝动蛋白结合的分子间相互作用

基本信息

批准号：
13J02335
负责人：
田中康太郎
金额：
$ 2.11万
依托单位：
Nagoya University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2013
资助国家：
日本
起止时间：
2013-04-01 至 2016-03-31
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-13J02335/
关键词：
アクチンコフィリン単粒子解析クライオ電子顕微鏡細胞骨格

项目摘要

電子顕微鏡画像処理プログラム Eos (安永、若林、1996)を用いて、らせん対称線維の単粒子解析プログラムを構築した。そのプログラムを用いて、コフィリンが飽和結合したアクチン線維（以下、cofilactin）の３次元構造を、クライオ電子顕微鏡像の単粒子解析により7.4 Å分解能で明らかにした。分子動力学計算によるモデル構築プログラム MDFF (Trabuco et al., 2008)を用いて、密度マップに基づくcofilactin原子構造モデルを構築した。D-loopはアクチン分子単量体において最もフレキシブルな部位であるが、アクチン線維形成時にはループ構造を取り、線維の上下のアクチン分子間を強固につなぐ重要な接着点として働くことがわかっている。また、コフィリンがアクチン線維に結合して線維の分子間相互作用を変えるためには、このD-loopによる接着点を弱体化する必要があると考えられていた。しかし本研究によるモデリングの結果、D-loopはαヘリックス構造としてモデル化した方が密度マップをよく説明するとわかった。αヘリックス構造をとると、D-loopの側鎖は隣接アクチン分子から離れる方向を向くため、コフィリンが分子間結合を破壊する文脈でこれは効率の良いシステムである。また、cofilactin原子構造モデルの静電ポテンシャルを計算して可視化したところ、ヘリックス構造へとフォールドしたD-loopが存在する空間は、アクチンの負電荷表面とコフィリンの正電荷表面に挟まれており、αヘリックスの電気双極子を安定化する方向の電場が生じているとわかった。この電場がD-loopのヘリックス構造転移を促進・安定化し、コフィリンの作用を助けている可能性がある。現在、コフィリンの正電荷表面の正電荷残基の電荷反転変異体・電荷消失変異体の発現系を構築し、電場の役割を実験的に確かめている。

使用电子显微镜图像处理程序EOS构建了用于螺旋对称纤维的单个粒子分析程序（Yasunaga，Wakabayashi，1996）。使用此程序，通过对低温电子显微镜的单个粒子分析，以7.4Å的分辨率揭示了肌动蛋白纤维（以下称为Cofilarctin）的三维结构。使用模型构建程序MDFF构建了基于密度图的Cofilactin原子结构模型（Trabuco等，2008）。 D-Loop是肌动蛋白分子单体中最柔韧的位点，但是当形成肌动蛋白纤维时，它已被发现采用循环结构，并充当一个重要的粘附点，该点牢固地连接了纤维上方和下方的肌动蛋白分子。人们还认为，为了使Cofilin与肌动蛋白纤维结合并改变纤维的分子间相互作用，有必要削弱由D环引起的粘附点。但是，这项研究的建模表明，通过将其建模为α-螺旋结构，可以更好地解释D环。使用α-螺旋结构，D环的侧链远离相邻的肌动蛋白分子，使其成为Cofilin破坏分子间键的有效系统。此外，当我们计算和可视化cofilactin原子结构模型的静电潜力时，发现将D-Loop折叠成螺旋结构的空间夹在肌动蛋白的负电荷表面和Cofilin阳性电荷表面之间，从而在稳定电力Dipole的方向上产生了电场，从而稳定了电源。该电场可能会促进和稳定D环的螺旋结构过渡，并有助于Cofilin的作用。当前，我们已经构建了一个表达系统，用于在Cofilin的正电荷表面上呈阳性电荷残基的电荷反转和电荷分散突变体，并通过实验验证电场的作用。