キチン系バイオマスの有効利用をめざした構造生物学：キトサン加水分解酵素

旨在有效利用基于甲壳素的生物质的结构生物学：壳聚糖水解酶

• 批准号: 13J03639
• 负责人: 新家 粧子
• 金额: $ 1.15万
• 依托单位: Kinki University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• 财政年份: 2013
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2013-04-01 至 2015-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-13J03639/
• 关键词: 糖質結合モジュール; キチン; キトサン; キトサナーゼ; NMR溶液構造

真菌類細胞壁に含まれるキチンおよびキトサンの有効利用を促進するため、構造生物学的手法によりキトサナーゼに存在するキトサン結合モジュール（DD1,DD2）の立体構造を明らかにし、キトサン認識機構を解明することを目的とした。DD1およびDD2の立体構造は、核磁気共鳴(NMR)法を用いた溶液構造解析により明らかにした。大腸菌発現系を用いて得られた13Cおよび15NラベルDD1、DD2を用い、1H-15N HSQCおよび3次元スペクトルの測定を行い、主鎖シグナルの帰属を行った。つづいて、1H-13C HSQC、HCCH-TOCSY、CCH-TOCSYの測定を行い、側鎖シグナルの帰属を行った。さらに、NOESYスペクトルの測定を行い、NOEを帰属し、CYANAプログラムによって構造計算を行った。その結果、DD1とDD2ともに、2枚のbetaシートからなるbetaサンドウィッチ構造を有し、その上下に突き出すようにいくつかのループ構造が存在することが明らかになった。さらにNMRを用いたキトサンオリゴ糖の滴定実験の結果、キトサンはDD1とDD2のbetaサンドウィッチ構造の上部のループ領域に結合することがわかった。また、結合に関与するアミノ酸残基の比較を行ったところ、DD１の36番目のグルタミン酸残基がDD2ではチロシン残基に置換していることがわかった。そこで、このアミノ酸残基について、DD1のグルタミン酸残基をチロシンに変異させたDD1-E36Yおよび、DD2のチロシン残基をグルタミン酸に変異させたDD2-Y36Eを作製し、キトサン結合実験を行った結果、DD1ではGlu36のチロシンへの変異が親和性大きく低下させ, また, DD2のTyr36のグルタミン酸への変異が親和性の増大をもたらした。以上のように、部位特異的変異によってCBMのリガンド特異性のコントロールが可能であることが示唆された。

Contains the cell walls of fungi に ま れ る キ チ ン お よ び キ ト サ ン の a sharper use を promote す る た め, structure of biology technique に よ り キ ト サ ナ ー ゼ に exist す る キ ト サ ン combining モ ジ ュ ー ル (DD1, DD2) の three-dimensional structure を Ming ら か に し, キ ト サ ン know institutions を interpret す る こ と を purpose と し た. DD1およびDD2 <s:1> stereoscopic construction, nuclear magnetic resonance (NMR) method を structural analysis using た た solution によ および Ming ら に に た た. Coliform 発 practice while department を い て must ら れ た 13 c お よ び 15 n ラ ベ ル DD1, DD2 を い, 1 h - 15 n HSQC お よ び three yuan ス ペ ク ト ル の line measurement を い, main lock シ グ ナ ル の 帰 を rows っ た. つ づ い て, 1 h - 13 c HSQC, HCCH TOCSY, CCH TOCSY の measurement line を い, side lock シ グ ナ ル の 帰 を rows っ た. さ ら に, NOESY ス ペ ク ト ル の determination を い, NOE を 帰 し, CYANA プ ロ グ ラ ム に よ っ て line structure calculation を っ た. そ の results, DD1 と DD2 と も に, two の beta シ ー ト か ら な る beta サ ン ド ウ ィ ッ チ tectonic を し, そ の fluctuation に tu き out す よ う に い く つ か の ル ー プ structure exist が す る こ と が Ming ら か に な っ た. さ ら に NMR を with い た キ ト サ ン オ リ ゴ sugar の titration be 験 の results, キ ト サ ン は DD1 と DD2 の beta サ ン ド ウ ィ ッ チ upper structure の の ル ー プ fields に す る こ と が わ か っ た. ま た, combined に masato and す る ア ミ ノ acid residues の is line を っ た と こ ろ, DD1 の 36 times eye の グ ル タ ミ ン acid residues が DD2 で は チ ロ シ ン residues に replacement し て い る こ と が わ か っ た. そ こ で, こ の ア ミ ノ acid residues に つ い て, DD1 の グ ル タ ミ ン acid residues を チ ロ シ ン に - different さ せ た DD1 - E36Y お よ び, DD2 の チ ロ シ ン residues を グ ル タ ミ ン acid に - different さ せ た DD2 - Y36E を as し, キ ト サ ン combination be 験 を line っ た results, DD1 で は Glu36 の チ ロ シ ン へ の Low - different が affinity big き く さ せ, ま た, DD2 の Tyr36 の グ ル タ ミ ン acid へ の - different が affinity の raised large を も た ら し た. Above の よ う に, site specific - different に よ っ て CBM の リ ガ ン ド specificity の コ ン ト ロ ー ル が may で あ る こ と が in stopping さ れ た.

项目成果

Interaction of di-N-acetylchitobiosyl moranoline with a family GH19 chitinase from moss, Bryum coronatum.

二-N-乙酰基壳二糖基吗啉与来自苔藓、Bryum coronatum 的 GH19 几丁质酶家族的相互作用。

• DOI: 10.1093/glycob/cwu052
• 发表时间: 2014
• 期刊: Glycobiology
• 影响因子: 4.3
• 作者: Shinya;S.;Urasaki;A.;Ohnuma;T.;Taira;T.;Suzuki;A.;Ogata;M.;Usui;T.;Lampela;O.;Juffer;AH.;Fukamizo;T.
• 通讯作者: T.

Paenibacillus sp. IK-5由来新規キトサン特異的糖質結合モジュールのキトサンオリゴ糖結合様式

源自类芽孢杆菌 IK-5 的新型壳聚糖特异性碳水化合物结合模块的壳聚糖寡糖结合模式。

• 发表时间: 2013
• 作者: 新家粧子;大沼貴之;山城玲奈;Padmanabhan Anbazhagan;André H. Juffer;木元久;草桶秀夫;深溝慶
• 通讯作者: 深溝慶

Mutation strategies for obtaining chitooligosaccharides with longer chains by transglycosylation reaction of family GH18 chitinase.

通过GH18几丁质酶家族的转糖基反应获得更长链的几丁寡糖的突变策略。

• DOI: 10.1080/09168451.2014.948373
• 发表时间: 2014
• 期刊: Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry
• 作者: Sirimontree;P.;Suginta;W.;Srinrho;N.;Kanda;Y.;Shinya;S.;Ohnuma;T.;Fukamizo;T
• 通讯作者: T

Paenibacillus sp.IK-5キトサナーゼに存在するキトサン結合モジュール (DD1) のNMR溶液構造とキトサン結合に関与するアミノ酸残基

类芽孢杆菌 IK-5 壳聚糖酶中存在的壳聚糖结合模块 (DD1) 的 NMR 溶液结构和参与壳聚糖结合的氨基酸残基

• 发表时间: 2014
• 作者: 新家粧子;西村重徳;木元久;草桶秀夫;大沼貴之;深溝慶
• 通讯作者: 深溝慶