バクテリア細胞における環境状態感知システムによる細胞内ネットワーク解析

バクテリアにおける細胞内ネットワーク解明をバーコードを導入した2種類のトランスポゾンを利用した超高効率網羅的2重欠失株解析法の確立を目的とした。すでに単一欠失株を遺伝子単位で、接合により組合せる方法を開発し解析を進めている。しかし、環境条件の違いによる細胞内ネットワーク構造の動的変化や、網羅的リソースが完備されていない非モデル生物においても適用可能な普遍性の高い方法論の開発は非常に重要である。1次元目のトランスポゾンをTn5で、2次元目をMarinerを利用した。Tn5はトランスポゼースが市販されるなど、一般的な利用が普及しているトランスポゾンであり、誰でもが利用しやすい環境を整える為に重要である。2次元目のMarinerトランスポゾンは、バクテリア由来ではなくAT配列を認識し挿入されるなどのバイアスも存在するが、すでにShewanellaなどのバクテリアでの実績があり、特性解析も進んでおり利用した。Tn5の断片の中に、loxあるいはFRTで挟まれたMarinerの断片を挿入する。Mariner断片には20塩基程度の分子バーコードとしてランダム配列を断片増幅時に導入を行う。一次元目のランダム挿入変異の位置の確定には、III型制限酵素認識部位を挿入したTn5末端挿入位置より25塩基までのゲノム配列と導入したバーコード領域を含む断片を調整し、シーケンサーで読み取る。その後、CreあるいはFLPにより、Mariner断片の切り出しと、トランスポゼースの誘導により、2次元目の転移を活性化する。これらを変異株プールとして様々な条件で培養を行い、生育への適合をシーケンサーにより変異位置同定頻度の違いで評価を行う。現在は、2種類のトランスポゾンを持つ上述の断片の作製を終了した。現在は、1および2次元目の転移活性化の効率の上昇を目指した条件検討を進めている。

バクテリアにおける細胞内ネットワーク解明をバーコードを導入した2種類のトランスポゾンを利用した超高効率網羅的2重欠失株解析法の確立を目的とした。すでに単一欠失株を遺伝子単位で、接合により組合せる方法を開発し解析を進めている。しかし、環境条件の違いによる細胞内ネットワーク構造の動的変化や、網羅的リソースが完備されていない非モデル生物においても適用可能な普遍性の高い方法論の開発は非常に重要である。1次元目のトランスポゾンをTn5で、2次元目をMarinerを利用した。Tn5はトランスポゼースが市販されるなど、一般的な利用が普及しているトランスポゾンであり、誰でもが利用しやすい環境を整える為に重要である。2次元目のMarinerトランスポゾンは、バクテリア由来ではなくAT配列を認識し挿入されるなどのバイアスも存在するが、すでにShewanellaなどのバクテリアでの実績があり、特性解析も進んでおり利用した。Tn5の断片の中に、loxあるいはFRTで挟まれたMarinerの断片を挿入する。Mariner断片には20塩基程度の分子バーコードとしてランダム配列を断片増幅時に導入を行う。一次元目のランダム挿入変異の位置の確定には、III型制限酵素認識部位を挿入したTn5末端挿入位置より25塩基までのゲノム配列と導入したバーコード領域を含む断片を調整し、シーケンサーで読み取る。その後、CreあるいはFLPにより、Mariner断片の切り出しと、トランスポゼースの誘導により、2次元目の転移を活性化する。これらを変異株プールとして様々な条件で培養を行い、生育への適合をシーケンサーにより変異位置同定頻度の違いで評価を行う。現在は、2種類のトランスポゾンを持つ上述の断片の作製を終了した。現在は、1および2次元目の転移活性化の効率の上昇を目指した条件検討を進めている。