Modeling esophageal/respiratory birth defects in human pluripotent stem cell (PSC)-derived fetal tissues

总结：在人PSC-E4衍生的胚胎组织中建模EA/TEF 在脊椎动物胚胎的发育过程中，一个共同的前肠管产生食道， 这涉及一系列复杂的分子和形态学过程。 背 前肠管形成食道，腹侧区域形成呼吸道，如果不能这样做， 导致气管食管出生缺陷，如食管闭锁和气管食管瘘（EA/TEF）。 如项目2中所讨论的，关于Wnt和BMP信号传导如何通过以下途径促进呼吸命运， 转录因子Nkx2.1的激活。 相比之下，对促食管因素知之甚少。 鼠标 和人类研究表明，HMG-1盒转录因子Sox 2参与了细胞的分离， 然而，Sox 2是否促进食管命运或作用于 主要抑制呼吸抑制诱导途径的背侧前肠尚不清楚。我们假设 机制参与正常的食管发育。 在人类中，大多数导致EA/TEF的基因仍然未被识别。 然而，SOX 2中的杂合突变 可导致EA和TEF，这与Sox 2杂合缺失的小鼠相反，这些小鼠是正常的。 然而，小鼠胚胎前肠内胚层Sox 2的完全缺失导致食管发育不全， Sox 2也在食管的肠神经系统（ENS）发育期间表达。鉴于 EA患者可能存在运动障碍，我们推测EA相关基因可能影响ENS 发展然而，一项关于EA-ENA相关突变如何不同地影响上皮和/或ENS的研究表明， 从来没有在任何物种身上做过更别说人类了 我们提出了几种新的PSC-100 基于研究Sox 2和其他EA-E2相关基因如何影响人食管特化的方法， 人多能干细胞来源的食管上皮细胞形态发生和功能性神经支配 具有肠神经系统的类器官 在这个项目中，我们的目标是确定食管特异性的机制， 通过首先关注关键的食管因子Sox 2来研究人类的发展。我们假设SOX 2 通过一个未知的基因，既抑制呼吸系统，又促进食管的命运 监管网络。我们将使用人PSC-E2衍生的前肠模型与SOX 2获得性表达和丧失性表达相结合， 识别被SOX 2抑制的呼吸GRN和被SOX 2抑制的食管GRN 依赖。相反，我们将确定NKX2.1是否抑制食管命运。我们将利用 人前肠培养物鉴定人SOX 2的直接转录靶标的可扩展性， NKX2.1使用RNA-测序和ChIP-测序。然后我们将研究TEF的发病机制 和由Sox 2突变引起的EA。我们将产生携带基于患者的突变的PSC系， SOX 2，并研究这些如何影响食管和呼吸系统谱系的形成。 我们将 确定SOX 2突变对Wnt和BMP信号传导的影响，以及Sox 2是否通过直接蛋白-BMP蛋白作用 与效应蛋白B-β连环蛋白/TCF和Smads的相互作用。 最后，我们将探讨如何EA 突变对食管的不同细胞类型有不同的影响; 和ENS。考虑到一些EA患者具有相关的运动障碍，包括失弛缓症3， 收缩4和巨食管5，我们将研究Sox 2突变是否也有ENS缺陷。我们将使用 来源于项目1和2中鉴定的EA/TEF患者的iPSC系，以模拟分子缺陷 使用我们的人PSC-GFP衍生的类器官模型来解释这种出生缺陷。

Summary: Modeling EA/TEF In Human PSC-­Derived Embryonic Tissues      During  development  of  the  vertebrate  embryo,  a  common  foregut  tube  gives  rise  to  the  esophagus  and  respiratory  tract  and  this  involves  an  array  of  complex  molecular  and  morphological  processes.  The  dorsal  foregut tube forms the esophagus and the ventral domain forms the respiratory tract, and failure to do so can  result in tracheaesophageal birth defects such as esophageal atresia and tracheoesophageal fistula (EA/TEF).  As  discussed  in  project  2,  much  is  known  about  how  Wnt  and  BMP  signaling  promote  a  respiratory  fate  by  activation  of  the  transcription  factor  Nkx2.1.  In  contrast,  little  is  known  about  pro-­esophageal  factors.  Mouse  and  human  studies  demonstrate  that  the  HMG-­box  transcription  factor  Sox2  is  involved  in  segregation  of  the  esophageal  and  respiratory  lineages,  however  whether  Sox2  promotes  an  esophageal  fate  or  acts  predominantly to repress respiratory-­inducing pathways the dorsal foregut is unclear. We hypothesize that both  mechanisms are involved in normal esophageal development.    In  humans,  most  genes  that  cause  EA/TEF  remain  unidentified.  However,  heterozygous  mutations  in  SOX2  can  cause  of  EA  and  TEF,  which  is  in  contrast  to  mice  with  heterozygous  loss  of  Sox2,  which  are  normal.  Complete loss of Sox2 from the foregut endoderm of mouse embryos results in esophageal agenesis, however  Sox2 is also expressed during development of the enteric nervous system (ENS) of the esophagus. Given that  patients  with  EA  can  have  motility  defects,  we  hypothesize  some  EA-­associated  genes  may  affect  ENS  development. However, a study of how EA-­associated mutations differentially affect the epithelium and/or ENS  of  the  esophagus  has  never  been  done  in  any  species,  let  alone  humans.  We  propose  several  novel  PSC-­ based approaches to study how Sox2 and other EA-­associated genes impact Human esophagus specification,  epithelial  morphogenesis,  and  functional  innervation  using  human  pluripotent  stem  cell-­derived  esophageal  organoids with an enteric nervous system.      In  this  project  we  aim  to  identify  the  mechanisms  underlying  esophageal  specification  and  development in humans by first focusing on the key esophageal factor Sox2. We hypothesize that SOX2  acts  both  to  repress  the  respiratory  lineage,  and  promote  an  esophageal  fate  via  an  unidentified  gene  regulatory network. We will use a human PSC-­derived foregut model in combination with SOX2 gain-­ and loss-­ of-­function  to  identify  a  respiratory  GRN  that  is  repressed  by  SOX2  and  an  esophageal  GRN  that  is  SOX2-­ dependant. Conversely we will determine if NKX2.1 represses the esophageal fate. We will take advantage of  the expandable nature of human foregut cultures to identify direct transcriptional targets of human SOX2 and  NKX2.1 using RNA-­seq and ChIP-­seq. We will then investigate the disease mechanisms underlying TEF  and EA that are caused by Sox2 mutations. We will generate PSC lines harboring patient-­based mutations in  SOX2  and  investigate  how  these  impact  the  formation  of  the  esophageal  and  respiratory  lineages.  We  will  identify  the  impact  of  SOX2  mutations  on  Wnt  and  BMP  signaling  and  if  Sox2  acts  by  direct  protein-­protein  interactions  with  the  effector  proteins  b-­catenin/TCF  and  Smads.  Lastly  we  will  investigate  how  EA  mutations differentially effect the different cell types of the esophagus;; the epithelial, smooth muscle  and  ENS.  Given  that  some  patients  with  EA  have  associated  motility  disorders  including  achalasia  3,  constrictions 4 and megaesophagus 5, we will investigate if Sox2 mutations also have ENS deficits. We will use  iPSC  lines  derived  from  EA/TEF  patients  identified  in  projects  1  and  2  to  model  the  molecular  deficits  underlying this birth defect using our human PSC-­derived organoid model.