Modeling esophageal/respiratory birth defects in human pluripotent stem cell (PSC)-derived fetal tissues

摘要：在人类PSC来源的胚胎组织中建立EA/TEF模型。 -- -- 在脊椎动物胚胎的发育过程中，一种常见的前肠管状结构可促进食道的生长和发育。 呼吸道疾病包括一系列复杂的分子生物学和形态生物学过程。 前肠管形成于下段食道，下腹段段形成于下呼吸道，如果不能做到这一点，就会出现这种情况。 导致气管食道出生缺陷，如食道闭锁和气管食道瘘(EA/TEF)。 正如我们在项目2中讨论的那样，关于WNT和BMP如何发出信号以促进人类呼吸暂停的命运，还有很多事情是未知的。 转录因子Nkx2.1的激活。与之形成对比的是，人们对促食道因子知之甚少。 而人类基因组研究也证明，转录因子Sox2的HMG-box基因也参与了人类的分离过程。 食道和呼吸道疾病的血统，然而，无论Sox2是促进食道疾病的命运还是其他行为。 目前尚不清楚这主要是为了抑制胃背侧的呼吸诱导通路。我们的假设是，这两种途径都适用。 他们的机制也参与了正常的食道发育。 -- 在人类中，大多数导致Ea/TEF的基因仍未确定。然而，一些杂合的基因突变发生在SOX2中。 这会导致EEA和TEF的异常，这与Sox2杂合性缺失的小鼠形成鲜明对比，这两种情况都很正常。 然而，从小鼠胚胎的正常前肠和内胚层中完全丢失Sox2蛋白会导致食道发育不全。 SOX2基因也在食道的肠神经系统疾病(ENS)的发育过程中表达出来。 患有EEA的患者可能会有运动性和缺陷，但我们可以假设一些与EEA相关的基因可能不会影响神经。 发展。然而，一项关于EA相关基因突变如何不同地影响血管上皮细胞和/或血管的研究报告。 在任何物种中都从未完成过食道修复，更不用说人类了。我们将提出几种全新的食道修复技术--PSC-- 基于研究Sox2基因和其他与EA相关的基因如何影响人类食道规范的方法。 上皮细胞的形态发生、功能和功能神经的支配，使用的是来自食道的人类多能干细胞。 有机化合物与肠道和神经系统有关。 -- 在这个项目中，我们的目标是进一步确定食道安全规范的基本机制。 人类的发展首先是专注于SOX2这一关键的食道致癌因素。我们假设SOX2是 这两种行为都是为了抑制人类的呼吸道疾病血统，并通过一种未知的基因来促进食道疾病的命运。 监管监管网络。我们将继续使用一个由PSC派生的更具人性化的未来模式，并将其与SOX2的收益和亏损相结合。 功能障碍是为了识别一个被SOX2基因抑制的呼吸系统GRN基因和一个被SOX2基因抑制的食道癌GRN基因。 家属。相反，我们将无法确定Nkx2.1是否会抑制食道癌的命运。我们将不会利用这一优势。 人类基因SOX2和SOX2基因的可扩充性和文化的可扩充性需要进一步确定人类基因SOX2和SOX2基因的直接转录和转录靶点。 Nkx2.1正在使用核糖核酸-seq和芯片-seq。然后我们将继续调查潜在的TEF的疾病和机制。 此外，EA表示，这些突变不是由Sox2基因突变引起的。我们不会生成包含基于患者的基因突变的PSC品系。 Sox2和他们调查了这些因素是如何影响食道系统和呼吸系统血统的形成的。 确定SOX2基因突变对Wnt基因和BMP信号转导系统的影响，并确定Sox2基因是否通过直接作用于蛋白质-蛋白质而起作用。 与效应蛋白的相互作用包括b-连环蛋白/Tcf和Smads。最后，我们将不会研究EA是如何发挥作用的。 突变对不同类型的食道上皮细胞有不同的影响；;是上皮细胞，是平滑的上皮细胞。 和失弛缓症。考虑到一些患有胃肠失弛缓症的患者与运动障碍相关，包括失弛缓症。 我们将不会调查Sox2基因突变是否也会导致赤字增加。我们将不会使用。 IPSC的这些线是从EEA/TEF中派生出来的，患者在第一个和第二个项目中被确定是什么，以建立一个新的分子生物学缺陷的模型。 这种出生缺陷的根本原因是使用了我们最新的人类PSC衍生的有机化合物模型。

Summary: Modeling EA/TEF In Human PSC-­Derived Embryonic Tissues      During  development  of  the  vertebrate  embryo,  a  common  foregut  tube  gives  rise  to  the  esophagus  and  respiratory  tract  and  this  involves  an  array  of  complex  molecular  and  morphological  processes.  The  dorsal  foregut tube forms the esophagus and the ventral domain forms the respiratory tract, and failure to do so can  result in tracheaesophageal birth defects such as esophageal atresia and tracheoesophageal fistula (EA/TEF).  As  discussed  in  project  2,  much  is  known  about  how  Wnt  and  BMP  signaling  promote  a  respiratory  fate  by  activation  of  the  transcription  factor  Nkx2.1.  In  contrast,  little  is  known  about  pro-­esophageal  factors.  Mouse  and  human  studies  demonstrate  that  the  HMG-­box  transcription  factor  Sox2  is  involved  in  segregation  of  the  esophageal  and  respiratory  lineages,  however  whether  Sox2  promotes  an  esophageal  fate  or  acts  predominantly to repress respiratory-­inducing pathways the dorsal foregut is unclear. We hypothesize that both  mechanisms are involved in normal esophageal development.    In  humans,  most  genes  that  cause  EA/TEF  remain  unidentified.  However,  heterozygous  mutations  in  SOX2  can  cause  of  EA  and  TEF,  which  is  in  contrast  to  mice  with  heterozygous  loss  of  Sox2,  which  are  normal.  Complete loss of Sox2 from the foregut endoderm of mouse embryos results in esophageal agenesis, however  Sox2 is also expressed during development of the enteric nervous system (ENS) of the esophagus. Given that  patients  with  EA  can  have  motility  defects,  we  hypothesize  some  EA-­associated  genes  may  affect  ENS  development. However, a study of how EA-­associated mutations differentially affect the epithelium and/or ENS  of  the  esophagus  has  never  been  done  in  any  species,  let  alone  humans.  We  propose  several  novel  PSC-­ based approaches to study how Sox2 and other EA-­associated genes impact Human esophagus specification,  epithelial  morphogenesis,  and  functional  innervation  using  human  pluripotent  stem  cell-­derived  esophageal  organoids with an enteric nervous system.      In  this  project  we  aim  to  identify  the  mechanisms  underlying  esophageal  specification  and  development in humans by first focusing on the key esophageal factor Sox2. We hypothesize that SOX2  acts  both  to  repress  the  respiratory  lineage,  and  promote  an  esophageal  fate  via  an  unidentified  gene  regulatory network. We will use a human PSC-­derived foregut model in combination with SOX2 gain-­ and loss-­ of-­function  to  identify  a  respiratory  GRN  that  is  repressed  by  SOX2  and  an  esophageal  GRN  that  is  SOX2-­ dependant. Conversely we will determine if NKX2.1 represses the esophageal fate. We will take advantage of  the expandable nature of human foregut cultures to identify direct transcriptional targets of human SOX2 and  NKX2.1 using RNA-­seq and ChIP-­seq. We will then investigate the disease mechanisms underlying TEF  and EA that are caused by Sox2 mutations. We will generate PSC lines harboring patient-­based mutations in  SOX2  and  investigate  how  these  impact  the  formation  of  the  esophageal  and  respiratory  lineages.  We  will  identify  the  impact  of  SOX2  mutations  on  Wnt  and  BMP  signaling  and  if  Sox2  acts  by  direct  protein-­protein  interactions  with  the  effector  proteins  b-­catenin/TCF  and  Smads.  Lastly  we  will  investigate  how  EA  mutations differentially effect the different cell types of the esophagus;; the epithelial, smooth muscle  and  ENS.  Given  that  some  patients  with  EA  have  associated  motility  disorders  including  achalasia  3,  constrictions 4 and megaesophagus 5, we will investigate if Sox2 mutations also have ENS deficits. We will use  iPSC  lines  derived  from  EA/TEF  patients  identified  in  projects  1  and  2  to  model  the  molecular  deficits  underlying this birth defect using our human PSC-­derived organoid model.