Modeling esophageal/respiratory birth defects in human pluripotent stem cell (PSC)-derived fetal tissues

摘要：模拟EA/TEF在人类PSC-衍生胚胎组织

Summary: Modeling EA/TEF In Human PSC-­Derived Embryonic Tissues      During  development  of  the  vertebrate  embryo,  a  common  foregut  tube  gives  rise  to  the  esophagus  and  respiratory  tract  and  this  involves  an  array  of  complex  molecular  and  morphological  processes.  The  dorsal  foregut tube forms the esophagus and the ventral domain forms the respiratory tract, and failure to do so can  result in tracheaesophageal birth defects such as esophageal atresia and tracheoesophageal fistula (EA/TEF).  As  discussed  in  project  2,  much  is  known  about  how  Wnt  and  BMP  signaling  promote  a  respiratory  fate  by  activation  of  the  transcription  factor  Nkx2.1.  In  contrast,  little  is  known  about  pro-­esophageal  factors.  Mouse  and  human  studies  demonstrate  that  the  HMG-­box  transcription  factor  Sox2  is  involved  in  segregation  of  the  esophageal  and  respiratory  lineages,  however  whether  Sox2  promotes  an  esophageal  fate  or  acts  predominantly to repress respiratory-­inducing pathways the dorsal foregut is unclear. We hypothesize that both  mechanisms are involved in normal esophageal development.    In  humans,  most  genes  that  cause  EA/TEF  remain  unidentified.  However,  heterozygous  mutations  in  SOX2  can  cause  of  EA  and  TEF,  which  is  in  contrast  to  mice  with  heterozygous  loss  of  Sox2,  which  are  normal.  Complete loss of Sox2 from the foregut endoderm of mouse embryos results in esophageal agenesis, however  Sox2 is also expressed during development of the enteric nervous system (ENS) of the esophagus. Given that  patients  with  EA  can  have  motility  defects,  we  hypothesize  some  EA-­associated  genes  may  affect  ENS  development. However, a study of how EA-­associated mutations differentially affect the epithelium and/or ENS  of  the  esophagus  has  never  been  done  in  any  species,  let  alone  humans.  We  propose  several  novel  PSC-­ based approaches to study how Sox2 and other EA-­associated genes impact Human esophagus specification,  epithelial  morphogenesis,  and  functional  innervation  using  human  pluripotent  stem  cell-­derived  esophageal  organoids with an enteric nervous system.      In  this  project  we  aim  to  identify  the  mechanisms  underlying  esophageal  specification  and  development in humans by first focusing on the key esophageal factor Sox2. We hypothesize that SOX2  acts  both  to  repress  the  respiratory  lineage,  and  promote  an  esophageal  fate  via  an  unidentified  gene  regulatory network. We will use a human PSC-­derived foregut model in combination with SOX2 gain-­ and loss-­ of-­function  to  identify  a  respiratory  GRN  that  is  repressed  by  SOX2  and  an  esophageal  GRN  that  is  SOX2-­ dependant. Conversely we will determine if NKX2.1 represses the esophageal fate. We will take advantage of  the expandable nature of human foregut cultures to identify direct transcriptional targets of human SOX2 and  NKX2.1 using RNA-­seq and ChIP-­seq. We will then investigate the disease mechanisms underlying TEF  and EA that are caused by Sox2 mutations. We will generate PSC lines harboring patient-­based mutations in  SOX2  and  investigate  how  these  impact  the  formation  of  the  esophageal  and  respiratory  lineages.  We  will  identify  the  impact  of  SOX2  mutations  on  Wnt  and  BMP  signaling  and  if  Sox2  acts  by  direct  protein-­protein  interactions  with  the  effector  proteins  b-­catenin/TCF  and  Smads.  Lastly  we  will  investigate  how  EA  mutations differentially effect the different cell types of the esophagus;; the epithelial, smooth muscle  and  ENS.  Given  that  some  patients  with  EA  have  associated  motility  disorders  including  achalasia  3,  constrictions 4 and megaesophagus 5, we will investigate if Sox2 mutations also have ENS deficits. We will use  iPSC  lines  derived  from  EA/TEF  patients  identified  in  projects  1  and  2  to  model  the  molecular  deficits  underlying this birth defect using our human PSC-­derived organoid model.