R-loop-induced DNA damage during immunoglobulin class switch recombination

免疫球蛋白类别转换重组过程中 R 环诱导的 DNA 损伤

• 批准号: 10217205
• 负责人: Jacqueline Barlow
• 金额: $ 31.4万
• 依托单位: UNIVERSITY OF CALIFORNIA AT DAVIS
• 依托单位国家: 美国
• 财政年份: 2019
• 资助国家: 美国
• 起止时间: 2019-08-05 至 2024-07-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://reporter.nih.gov/project-details/10217205
• 关键词: Animal Model; Antibodies; Automobile Driving; B-Lymphocytes; Biology; Cell physiology; Cells; Cellular biology; Chromatin; Chromosome Fragile Sites; Collaborations; Complex; DNA; DNA Damage; DNA Double Strand Break; DNA Repair; DNA Repair Gene; DNA Repair Pathway; DNA Sequence Rearrangement; Defect; Development; Dissection; Enzymes; Event; Excision; Frequencies; G22P1 gene; Gene Rearrangement; Generations; Genetic Processes; Genetic Transcription; Genomic Instability; Genomics; Goals; Heavy-Chain Immunoglobulins; Human; Hybrids; Hypersensitivity; IGH@ gene cluster; Immunoglobulin Class Switching; Immunoglobulin Switch Recombination; Immunoglobulins; Ligase; Location; Lymphocyte; Lymphomagenesis; Malignant Neoplasms; Malignant lymphoid neoplasm; Maps; Mediating; Metabolism; Molecular; Monitor; Mus; Mutation; Nonhomologous DNA End Joining; Oncogenic; Pathway interactions; Pharmaceutical Preparations; Play; Production; Proteins; RAD52 gene; RNA; Recurrence; Research Personnel; Ribonucleases; Ribonucleotides; Role; SETX gene; Site; Structure; Techniques; Testing; Transcriptional Activation; Work; cancer cell; cancer therapy; chromosome fusion; defined contribution; experience; genome-wide; genomic locus; helicase; homologous recombination; inhibitor/antagonist; innovation; insertion/deletion mutation; insight; mouse model; mutant; novel; nuclease; public health relevance; recruit; repaired; replication stress; synergism; tumorigenesis

Project Summary/Abstract    Class switch recombination (CSR) is a genetic process where a B cell switches antibody isotype  production through site-­specific intra-­chromosomal DNA rearrangement stimulated by the formation  of DNA double-­strand breaks (DSBs) at the immunoglobulin heavy chain (IgH) locus. DSBs are  normally repaired by the non-­homologous end-­joining (NHEJ) and alternative-­end joining (alt-­EJ)  DNA repair pathways. During CSR, DSB formation is highly regulated involving a complex interplay of  transcriptional activation, protein recruitment and chromatin reorganization. Understanding the factors  regulating DSB formation and repair has a high impact on lymphomagenesis. R loops are three  stranded RNA:DNA hybrid structures formed at IgH during CSR. While R loops are implicated in  promoting DSB formation at IgH, their role in class switch recombination remains undefined. We find  that mice defective for R loop removal are proficient at class switch recombination, however B cells  contain unrepaired breaks and chromosome fusions at IgH. Recurrent oncogenic translocations  involving IgH distinguish many human lymphoid malignancies. These translocations originate from  mis-­repaired DNA double stand breaks (DSBs) generated during normal lymphocyte development.  Our goal is to determine how persistent R loops impede DNA repair during CSR, and the role R loop  metabolism plays in suppressing genome instability at IgH. We hypothesize that persistent R loops  block efficient DNA repair by non-­homologous end joining at the immunoglobulin heavy chain  locus during class switch recombination, leading to persistent, unrepaired breaks. To test this  hypothesis, two mouse models will be employed: the SETX mutant lacks the Senataxin (SETX)  helicase that unwinds R loops;; and Rnaseh2b is defective for the RNase H2 nuclease that specifically  digests the RNA component of R loops (RNH2B). We will functionally dissect the consequences of  aberrant R loop formation on DNA repair and chromosome fusions arising during CSR in SETX-­/-­,  RNH2Bf/f, and SETX-­/-­ RNH2Bf/f cells (Aim 1). To define the impact persistent R loops have on NHEJ,  we will characterize DNA repair protein recruitment in SETX-­/-­, RNH2Bf/f, and SETX-­/-­ RNH2Bf/f cells  (Aim 2). We will also identify genomic loci involved in IgH translocations using high-­throughput  genome-­wide translocation sequencing (HTGTS-­Seq), in collaboration with Dr. Feyredoun  Hormozdiari. Finally, we will define the molecular pathways driving the frequent chromosome fusions  observed in SETX-­/-­ RNH2Bf/f cells (Aim 3). Our work will define how persistent R loops interfere with  class switch recombination, leading to unrepaired breaks, and will uncover the molecular  mechanisms promoting chromosome fusions at IgH. Enzymes regulating R loop metabolism will also  provide an attractive target for developing novel cancer treatment.

项目总结/摘要   类别转换重组（CSR）是B细胞转换抗体同种型的遗传过程 通过位点特异性的染色体内DNA重排产生， 免疫球蛋白重链（IgH）基因座处的DNA双链断裂（DSB）。 正常情况下通过非同源末端连接（NHEJ）和交替末端连接（alt-HEJ）修复. 在CSR过程中，DSB的形成受到高度调节，涉及以下因素的复杂相互作用： 转录激活、蛋白质募集和染色质重组。 调节DSB的形成和修复对淋巴瘤的发生有很大的影响。 在CSR过程中，IgH上形成了RNA：DNA的杂交结构。 促进DSB在IgH的形成，它们在类别转换重组中的作用仍然不确定。 R环缺失的小鼠在类别转换重组方面是熟练的，然而B细胞 含有未修复的断裂和IgH处的染色体融合。 涉及IgH区分许多人类淋巴系统恶性肿瘤。这些易位起源于 错配修复正常淋巴细胞发育过程中产生的DNA双链断裂（DSB）。 我们的目标是确定持续的R环如何阻碍CSR期间的DNA修复，以及R环的作用 我们假设持续的R环在抑制IgH基因组的不稳定性中起作用。 通过免疫球蛋白重链处的非同源末端连接阻断有效的DNA修复 基因座在类别转换重组，导致持久的，未修复的断裂。为了测试这一点， 假设，将采用两种小鼠模型：SETX突变体缺乏Senataxin（SETX） 解旋R环的解旋酶; RNase 2b和RNaseH 2核酸酶是缺陷的，RNaseH 2核酸酶特异性 介绍了R环的RNA成分（RNH 2B）。我们将从功能上剖析 在SETX-β/β中CSR期间产生的DNA修复和染色体融合中的异常R环形成， RNH 2Bf/f和SETX-RNH 2Bf/f细胞（目标1）。为了定义持续R环对NHEJ的影响， 我们将描述SETX-β/-β、RNH 2Bf/f和SETX-β/-β RNH 2Bf/f细胞中DNA修复蛋白的募集 (Aim 2）我们还将使用高通量PCR技术鉴定IgH易位所涉及的基因组位点。 全基因组易位测序（HTGTS-SEQ），与Feyredoun博士合作 最后，我们将定义驱动频繁染色体融合的分子途径 我们的工作将定义持久的R环如何干扰SETX-β-RNH 2Bf/f细胞（目标3）。 类开关重组，导致未修复的断裂，并将揭示分子 调节R环代谢的酶也将促进IgH处的染色体融合。 为开发新的癌症治疗提供了有吸引力的靶点。