Metallobiochemistry of Mn/Fe protein cofactors

Mn/Fe 蛋白质辅因子的金属生物化学

• 批准号: 10466938
• 负责人: Hannah S Shafaat
• 金额: --
• 依托单位: OHIO STATE UNIVERSITY
• 依托单位国家: 美国
• 财政年份: 2018
• 资助国家: 美国
• 起止时间: 2018-09-01 至 2023-06-30
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://reporter.nih.gov/project-details/10466938
• 关键词: Active Sites; Aerobic; Binding; Catalysis; Chemicals; Chlamydia; Chlamydia trachomatis; Coupled; Development; Directed Molecular Evolution; Electron Spin Resonance Spectroscopy; Electron Transport; Electrons; Environment; Enzymes; Genus Mycobacterium; Goals; Immune system; Kinetics; Knowledge; Metalloproteins; Metals; Microbe; Modeling; Molecular; Mutagenesis; Mycobacterium tuberculosis; Natural regeneration; Nitrogen; Optics; Organism; Oxidation-Reduction; Oxygen; Pathogenicity; Physiologic pulse; Physiological; Play; Process; Property; Protein Engineering; Proteins; Reaction; Research; Resistance; Role; Site; Techniques; Thermodynamics; Time; Transition Elements; Virulence; Work; chemical property; cofactor; design; electronic structure; geometric structure; oxidation; pathogen; programs; scaffold; targeted treatment

Project Summary/Abstract    This  research  program  will  establish  the  fundamental  chemical  principles  underlying  the  newly  discovered  Mn/Fe  proteins.  The  active  sites  of  these  proteins  defy  conventional  inorganic  wisdom  to  spontaneously  assemble  a  bimetallic  cofactor  that  contains  two  different  transition  metals  in  nearly  identical  coordination  environments.  Following  assembly,  oxygen  is  activated  across  the  metal  centers  to  induce  a  one-­  or  two-­ electron  oxidation  reaction,  with  regeneration  occurring  via  intermolecular  electron  transfer.  Unlike  the  well-­ studied  diiron  enzyme  homologs,  the  molecular-­level  details  of  these  processes  in  Mn/Fe  proteins  remain  unknown.  Because  Mn/Fe-­containing  proteins  have  been  identified  primarily  in  extremophilic  and  pathogenic  organisms,  including  many  species  of  Chlamydia  and  Mycobacteria,  it  has  been  suggested  that  the  heterobimetallic  cofactor  may  offer  resistance  against  reactive  nitrogen  and/or  oxygen  species  generated  by  the host immune system. The proposed studies will probe this hypothesis using the R2lox proteins as a model  scaffold,  examining  reactivity  of  the  Mn/Fe  cofactor  relative  to  a  diiron  site.  Initial  studies  by  the  PI  have  indicated  aerobic  assembly  of  R2lox  proceeds  through  two  distinct  intermediates,  identified  by  time-­resolved  optical  and  EPR  spectroscopy.  The  proposed  work  will  use  an  array  of  spectroscopic  techniques,  including  optical,  resonance  Raman,  CW-­  and  pulsed  EPR,  and  Mössbauer,  to  elucidate  the  electronic  and  geometric  structures  of  these  intermediates.  Targeted  mutagenesis  around  the  active  site  will  allow  identification  of  key  residues  responsible  for  selective  metal  binding,  ultimately  revealing  the  mechanism  by  which  assembly  and  activation  proceed.  To  gain  a  comprehensive  picture  of  the  processes  occurring  at  the  active  site,  the  redox  properties  of  Mn/Fe  cofactors  will  be  characterized  to  determine  the  thermodynamics  and  kinetics  of  electron  transfer, a necessary component for efficient catalysis. Finally, the scope of reactivity of Mn/Fe proteins will be  expanded  using  protein  engineering  techniques.  Rational  metalloprotein  design  will  be  coupled  with  directed  evolution approaches to generate highly active enzymes capable of selective oxidation of targeted substrates.  Collectively,  the  proposed  research  program  will  fill  many  existing  knowledge  gaps  about  the  Mn/Fe  proteins,  better  resolving  the  physiological  role  that  these  unique  cofactors  may  play  in  the  metallobiochemistry  of  microbes.

项目摘要/摘要：项目摘要。 这项新的研究计划将进一步确立新发现的基础化学物质的基本原理。 Mn/Fe代表蛋白质。这些蛋白质中最活跃的位点可能会挑战传统的无机蛋白质自发合成的智慧。 组装一种双金属辅因子，它包含两种不同的过渡金属，其配位几乎完全相同。 环境。在组装之后，整个金属中心的氧气都被激活，以诱导一到两个月的呼吸。 电子被氧化和反应，其中的再生是通过分子间电子和电子的转移进行的。它不同于传统的电子。 研究了二铁酶和同源物，发现了这些过程的分子水平和细节，这些过程可能会在蛋白质中保持不变。 未知。这是因为尚未发现含有锰/铁的蛋白质，主要存在于极端嗜热性病毒和致病病毒中。 包括包括衣原体和分枝杆菌在内的许多重要物种的生物体，也被认为是导致这种疾病的原因。 异双金属辅因子可能还会对细菌产生的活性氮和/或氧物种提供更好的抵抗力。 宿主是免疫系统。在这项拟议的研究中，我们将以R2lox蛋白为模型，进一步探索这一假说。 脚手架，通过检测锰/铁辅助因子的反应性，可以相对地建立一个铁的结合部位。这是由铁皮研究所进行的初步研究。 表明R2lox收益的好氧组装过程是通过两个不同的中间体进行的，这两个中间体是由时间分辨的中间体确定的。 光学扫描和电子顺磁共振光谱学。这项拟议的工作计划将继续使用一系列新的光谱分析技术，包括。 光学、共振、拉曼、连续波和脉冲脉冲的EPR、和Mössbauer，试图阐明最新的电子技术和几何技术。 包括这些中间体的结构。有针对性的突变存在于最活跃的基因位点周围，这将不会允许对关键基因的鉴定。 残留物是选择性结合金属的主要原因，最终揭示了组装过程中的作用机制。 激活将继续进行。以获得在最活跃的氧化还原现场发生的所有过程的最全面的图片，包括最新的氧化还原。 此外，还将对锰/铁等辅因子的性质进行表征，以确定电子的热力学和动力学性质。 转移，这是高效催化的一个必要的组份。最后，将不会扩大锰/铁离子蛋白的活性范围。 扩大了利用蛋白质工程技术的应用。合理的金属蛋白质芯片设计方案将与定向设计技术完美结合。 进化是一种方法，可以产生一种高度活跃的酶，能够选择性地氧化特定的靶向底物。 总体而言，拟议的研究计划将填补许多现有的关于MnN/Fe蛋白质的知识和空白。 更好地解决这些独一无二的辅助因子可能在人类最新的矿物生物化学研究中发挥作用的生理机制。 微生物。