GENETIC AND MOLECULAR STUDIES OF RNA SPLICING

RNA 剪接的遗传学和分子研究

基本信息

  • 批准号:
    2176144
  • 负责人:
  • 金额:
    $ 26.39万
  • 依托单位:
  • 依托单位国家:
    美国
  • 项目类别:
  • 财政年份:
    1990
  • 资助国家:
    美国
  • 起止时间:
    1990-08-01 至 1995-11-30
  • 项目状态:
    已结题

项目摘要

The long-term goals of this research are to 1) develop new insights to the structure of group II introns of yeast mtDNA and roles of those structures in splicing reactions in vivo and in vitro; 2) study the function of a maturase protein encoded by a group IIA intron in splicing; 3) develop and test models for two genetic phenomena dependent on the group IIA introns; and 4) purify and characterize mutant and wild-type proteins encoded by group II introns. The validity of predicted tertiary structures will be tested in vivo by transforming relevant mutant alleles into mtDNA; the in vivo phenotypes will be determined and second-site revertants isolated and characterized. We have discovered a crucial tertiary interaction between domain 5 and domain 1 of group II introns that is necessary for reactions at both splice junctions. Further insight to the functional importance of specific sequences and structures within domain 5 will be obtained by screening randomized domain 5-containing RNAs for retained function using a trans-splicing assay. Mutants of domain 5 will be transformed into mitochondria and second-site suppressors characterized in order to define regions of the intron with which it interacts. The reading frame of the group IIA intron resembles reverse transcriptase and also contains a zinc-finger like domain; nearly all group II introns with reading frames have those features and additionally other highly conserved segments not resembling a known protein are present. We will mutate each of those regions, transform the mutations into mitochondria and determine the effect on splicing. Reading frame mutants will be tested for their effect on two genetic phenomena that appear dependent on that intron, namely, reversion of splicing defective mutants by intron excision (RIE) and group II intron mobility. Biochemical experiments will be carried out to test predictions of models for those processes. And finally, wild-type and mutant forms of proteins encoded by group II introns will be purified from mitochondrial extracts and characterized; in vitro assays for splicing, nucleic acid splicing and/or reverse transcriptase will be tested.
这项研究的长期目标是:1)发展新的见解 酵母线粒体DNA第二组内含子的结构及其作用 体内外剪接反应中的结构;2) 研究IIA组编码的成熟酶蛋白的功能 剪接中的内含子;3)开发和测试两个基因的模型 依赖于IIA组内含子的现象;以及4)纯化和 II组编码的突变型和野生型蛋白的特性 内含子。预测的三级结构的有效性将是 通过将相关突变等位基因转化为mtDNA进行体内测试; 体内表型将被确定和第二位点 分离并鉴定了返回菌。我们发现了一个 基团的结构域5和结构域1之间的关键第三方相互作用 II两个剪接反应所必需的内含子 交汇点。对功能重要性的进一步了解 将获得结构域5内的特定序列和结构 通过筛选含有随机化结构域5的RNA进行保留 功能使用反式剪接实验。结构域5的突变体将 转化为线粒体和第二位点抑制因子 其特征是为了定义内含子的区域 它会相互作用。IIA组内含子的阅读框架类似于 逆转录酶,还含有锌指结构域; 几乎所有带有阅读框的第二类内含子都有这些特征 此外,其他高度保守的片段不类似于 已知的蛋白质存在。我们将突变这些区域中的每一个, 将突变转化为线粒体并确定其影响 关于拼接。将测试阅读框突变体的效果 两种遗传现象似乎依赖于该内含子, 即通过内含子切除逆转剪接缺陷突变体 (RIE)和第二类内含子迁移率。生化实验将会 以测试对这些过程的模型的预测。 最后,野生型和突变型蛋白质由 第二组内含子将从线粒体提取液和 体外剪接试验、核酸剪接试验 和/或逆转录酶将被检测。

项目成果

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