RECOMBINATION IN VITRO--ENZYMOLOGY AND INTERMEDIATES

体外重组——酶学和中间体

基本信息

  • 批准号:
    2701513
  • 负责人:
  • 金额:
    $ 47.17万
  • 依托单位:
  • 依托单位国家:
    美国
  • 项目类别:
  • 财政年份:
    1984
  • 资助国家:
    美国
  • 起止时间:
    1984-05-01 至 1999-04-30
  • 项目状态:
    已结题

项目摘要

E. Coli RecA protein forms a right-handed helical nucleoprotein filament on single-stranded DNA which catalyzes a search for homology, assimilates homologous duplex DNA, and effects the complete exchange of strands to produce a new heteroduplex recombinant. This protein appears to be the prototype of homologous recombination proteins that have recently been found to be universally distribute in nature, including Homo sapiens. The university of such proteins underscores the importance of understanding their molecular mechanisms, which may be important in disease processes that involve derangements of repair and recombination, and which will be of increasing interest in regard to gene targeting and gene therapy. The mechanisms of homologous pairing and strand exchange via the helical recombination filament are still not well understood, but intermediates have been identified and isolated that permit further enzymological and chemical probing. Recent studies have revealed that RecA protein can catalyze homologous recognition through the formation of non-Watson-Crick bonds. Experiments are proposed to probe the nature and role of these intermediates to test the hypothesis that homologous recognition is accomplished by a non-Watson-Crick interaction between a RecA coated single strand and duplex DNA. The rotation of DNA has been shown to be important in strand exchange. Experiments will test the hypothesis that rotation is accomplished by the coaxial rotation of DNA within the nucleoprotein filament. Experiments in vitro reveal the strand exchange phase of the recombination reaction only when a substrate is provided with an appropriate free end. A search will be made for enzymes that will cleave the initial synaptic complex made by RecA protein into one that can progress to the next stage of strand exchange. To this end, substrates and assays will be developed that can be used in crude extracts. Such methods may prove useful in the enzymolifocal approach to homologs of RecA protein in eukaryotes. The short term goals of the proposed research are to gain understanding of the mechanisms of homologous recognition and strand exchange and to discover how the intermediate that is generated by RecA protein is further processed. The long term goals are to understand the pathways of recombination mediated by RecA protein and its homologs, and to use that knowledge to facilitate gene targeting and gene therapy.
大肠杆菌 RecA 蛋白形成右手螺旋核蛋白丝 在单链DNA上催化同源性的搜索,同化 同源双链 DNA,并实现链的完全交换 产生新的异源双链重组体。 这种蛋白质似乎是 最近被研究出来的同源重组蛋白的原型 发现广泛分布于自然界,包括智人。 此类蛋白质的大学强调了 了解它们的分子机制,这对于 涉及修复和重组紊乱的疾病过程, 这对于基因靶向和 基因疗法。 同源配对和链交换的机制 通过螺旋重组丝仍然没有被很好地理解,但是 中间体已被鉴定和分离,可以进一步 酶学和化学探测。 最近的研究表明 RecA蛋白可以通过形成催化同源识别 非沃森-克里克债券。 建议进行实验来探究本质 以及这些中间体的作用来检验同源假设 识别是通过a之间的非沃森-克里克相互作用来完成的 RecA 包被的单链和双链 DNA。 DNA 的旋转是 表明在链交换中很重要。 实验将测试 旋转是通过 DNA 同轴旋转完成的假设 核蛋白丝内。 体外实验揭示 仅当底物存在时重组反应的链交换阶段 设有适当的自由端。 将进行搜索 将裂解 RecA 产生的初始突触复合体的酶 蛋白质转化为可以进入下一阶段链交换的蛋白质。 为此,将开发可用于 粗提物。 这些方法可能被证明在酶焦点 真核生物中 RecA 蛋白同源物的方法。 短期目标 拟议研究的目的是为了了解 同源识别和链交换并发现如何 RecA 蛋白产生的中间体被进一步加工。 这 长期目标是了解重组介导的途径 RecA 蛋白及其同系物,并利用这些知识来促进 基因靶向和基因治疗。

项目成果

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