REGULATION OF HUMAN KERATINOCYTE GENE EXPRESSION BY TPA

TPA 对人类角质形成细胞基因表达的调节

• 批准号: 3162189
• 负责人: Noreen J Hickok
• 金额: $ 17.38万
• 依托单位: THOMAS JEFFERSON UNIVERSITY
• 依托单位国家: 美国
• 财政年份: 1992
• 资助国家: 美国
• 起止时间: 1992-08-01 至 1995-07-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://reporter.nih.gov/project-details/3162189
• 关键词: RNA binding protein; biomarker; chimeric proteins; enzyme activity; gene deletion mutation; genetic regulation; genetic translation; human genetic material tag; immunoprecipitation; keratinocyte; messenger RNA; ornithine decarboxylase; phorbols; site directed mutagenesis; tissue /cell culture; transfection

The phorbol ester, 12-0-tetradecanoyl-phorbol-13-acetate (TPA) is a potent tumor promoter and causes epidermal hyperplasia in dermatological systems. In human keratinocytes, TPA induces epidermal differentiation and suppresses ornithine decarboxylase (ODC) activity without causing any concomitant changes in ODC mRNA levels. In contrast, in mouse skin, TPA is a proliferative agent, and causes increases in ODC activity, mRNA levels, and gene transcription rates; this increase in ODC activity appears to be necessary for tumor promotion, suggesting an important role for ODC in carcinogenesis. TPA thus has opposite effects in human and mouse, and the goal of these studies is to elucidate the mechanisms whereby TPA suppresses ODC gene expression in human keratinocytes. As TPA decreases ODC synthetic rates, and also appears to decrease ODC protein stability, we propose that TPA regulates ODC gene expression by regulating ODC mRNA translatability and by altering ODC enzyme half-life. The mechanisms of these effects will be studied by (1) elucidating the effects of TPA on the expression of transfected human ODC cDNA in human and mouse keratinocytes, (2) assessing the role of the ODC mRNA 51-noncoding (5'-nc) region in mediating the effect of TPA on ODC mRNA translatability by transfection of 5'-nc region deletants, (3) elucidating if the effect of TPA on ODC mRNA translatability is mediated by protein binding to the ODC mRNA 5'-nc region using RNA-protein UV cross-linking assays, (4) determining which sequences in the ODC protein mediate its destabilization by TPA, by transfection of probein-coding region deletants and determining enzyme half-life, and (5) isolating the protein(s) interacting with the ODC sequences that mediates the effect of TPA on ODC enzyme half-life through co-immunoprecipitation with ODC enzyme or through conventional protein purification techniques. We will thus obtain an understanding of the mechanisms by which TPA causes changes in ODC gene expression in human keratinocytes, and how, in mouse skin. TPA can cause tumor-promotion, whereas in human keratinocytes, TPA can cause cellular differentiation. This information will give us greater insight into skin cell proliferation, thereby contributing to the development of rational treatments of human epidermal disease.

佛波酯 12-0-十四烷酰基-佛波醇-13-乙酸酯 (TPA) 是 有效的肿瘤促进剂并导致表皮增生 皮肤科系统。 在人角质形成细胞中，TPA 诱导 表皮分化并抑制鸟氨酸脱羧酶 (ODC) 活性，但不会引起 ODC mRNA 的任何伴随变化 水平。 相比之下，在小鼠皮肤中，TPA 是一种增殖剂， 并导致 ODC 活性、mRNA 水平和基因增加 转录率； ODC 活动的增加似乎是 肿瘤促进所必需的，表明 ODC 的重要作用 在致癌过程中。 因此，TPA 对人类和人类具有相反的影响 小鼠，这些研究的目的是阐明其机制 TPA 可以抑制人角质形成细胞中 ODC 基因的表达。 随着 TPA 降低 ODC 合成率，并且似乎也降低 ODC蛋白稳定性，我们提出TPA调控ODC基因 通过调节 ODC mRNA 翻译性和改变 ODC 酶半衰期。 这些影响的机制将是 研究通过（1）阐明TPA对表达的影响 在人和小鼠角质形成细胞中转染人 ODC cDNA，(2) 评估 ODC mRNA 51 非编码 (5'-nc) 区域在 TPA 对 ODC mRNA 翻译能力的影响 5'-nc 区域删除子的转染，(3) 阐明是否 TPA 对 ODC mRNA 翻译能力的影响是由蛋白质介导的 使用 RNA 蛋白 UV 结合 ODC mRNA 5'-nc 区域 交联测定，(4) 确定 ODC 中的哪些序列 蛋白质通过 TPA 介导其不稳定，通过转染 探针编码区缺失并确定酶半衰期， (5) 分离与 ODC 序列相互作用的蛋白质 通过介导 TPA 对 ODC 酶半衰期的影响 与 ODC 酶或通过常规方法进行免疫共沉淀 蛋白质纯化技术。 我们将因此获得一个 了解 TPA 引起 ODC 变化的机制 人类角质形成细胞中的基因表达，以及小鼠皮肤中的基因表达。 TPA 可促进肿瘤生长，而在人类角质形成细胞中，TPA 能引起细胞分化。 这些信息将为我们提供 更深入地了解皮肤细胞增殖，从而有助于 人类表皮的合理治疗方法的发展 疾病。