DEVELOPMENT OF EXPRESSION CLONING SYSTEM FOR ONCOGENE CDNAS

癌基因 CDNAS 表达克隆系统的开发

基本信息

项目摘要

We are developing a cDNA expression cloning system for isolation of dominant as well as recessive oncogenes. ln this system. cDNA libraries are constructed in eukaryotic expression vectors using poly(A)-selected RNAs from transformants or tumors. The library DNA can then be used to transfect NIH/3T3 cells. cDNA clones will be recovered from resulting foci, and their structures analyzed. In order to make expression cloning feasible for this purpose, cDNA libraries containing complete coding sequences will be necessary. At this point, we have developed a high efficiency cDNA cloning system which can direct the orientation of inserts in eukaryotic expression vectors which possess large cloning capacities. Our lambda-plasmid composite vectors contain a retroviral long terminal repeat (LTR) promoter to express cDNA and a simian virus 40 (SV40) early promoter-driven neo gene as a eukaryotic cell selection marker. cDNA was synthesized from a linker-primer containing the site for SfiI, an infrequent cutter of DNA. An adaptor was ligated at both ends of the double-stranded cDNA molecules, cleaved by SfiI, and ligated with the lambda vector arms prepared by cutting at two different SfiI sites. Due to the directional cloning strategies and non-symmetrical structure of sticky ends of both the vector and insert DNAs, the efficiencies of 10 to 100 million plaque-forming units of phages were obtained from one microgram of poly(A)-selected RNA. Furthermore, we have shown that our libraries contain cDNAs for several growth factors and receptors that are nearly full length molecules of 2.5 to 6.5 kb, at high frequencies.
我们正在开发一个cDNA表达克隆系统, 显性和隐性致癌基因的结合。 在这个系统里。cDNA 文库在真核表达载体中构建, 来自转化体或肿瘤的poly(A)选择的RNA。 图书馆 然后可以使用DNA转染NIH/3 T3细胞。 cDNA克隆将 从所得病灶中回收,并分析其结构。 为了使为此目的的表达克隆变得可行,cDNA 将需要含有完整编码序列的文库。 至此,我们建立了一个高效的cDNA克隆 在真核生物中可以指导插入物方向的系统 具有大克隆能力的表达载体。 我们 双链-质粒复合载体含有逆转录病毒长末端 重复序列(LTR)启动子表达cDNA和猿猴病毒40(SV 40) 早期启动子驱动的neo基因作为真核细胞选择 标记。 cDNA由含有以下的接头引物合成: SfiI位点,一种罕见的DNA切割器。 连接接头 在双链cDNA分子的两端, SfiI,并与通过切割制备的λ载体臂连接 在两个不同的SfiI站点。 由于定向克隆 策略和粘性末端的非对称结构, 载体和插入DNA,效率为10至100万 从1微克的 poly(A)-选择性RNA。 此外,我们还表明, 文库含有几种生长因子和受体的cDNA 它们几乎是2.5到6.5 kb的全长分子, 频率.

项目成果

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