Host-Oriented Therapeutics Targeting Filovirus Budding.

丝状病毒（埃博拉和马尔堡）引起严重的出血热综合征，死亡率高。作为 这些RNA病毒被归类为NIAID A类病原体，目前缺乏有效的疫苗， 对这些致命病原体的抗病毒治疗是特别令人关注的。 我们和其他人已经建立了 丝状病毒的有效出芽关键取决于宿主蛋白Tsg 101和Nedd 4的破坏， 病毒PTAP和PPxY晚期（L）出芽结构域分别对这些相互作用至关重要。 作为 破坏病毒萌芽将阻止病毒传播，我们建议直接评估 破坏Tsg 101-PTAP和Nedd 4-PPxY相互作用，从而防止病毒 发芽 我们的合作者，博士迈克尔李和马克奥尔森（USAMRIID，英尺。 Detrick，MD），使用了 Tsg 101-PTAP和Nedd 4-PPxY相互作用的已知结构，以指导 竞争性相互作用阻断剂。我们目前正在评估顶级候选抑制剂的能力， 病毒样颗粒（VLP）出芽试验中病毒颗粒的宿主依赖性排出。 由于Tsg 101是PTAP， Nedd 4-PPxY相互作用太弱和/或短暂而不能通过标准生物化学方法检测， 我们的实验室已经成功地开发了一种强大的双分子互补（BiMC）方法来检测 这些病毒在活细胞中与宿主相互作用。我们将使用这种创新技术来确定候选人是否 抑制剂破坏这些病毒与宿主的相互作用。 用一种先导化合物（5539 μ g）进行初步研究， #20062;的可行性。由于含有基质蛋白的L β结构域是高效表达所必需的， 病毒-细胞分离许多RNA病毒，包括逆转录病毒，沙粒病毒，弹状病毒， 副粘病毒，亨尼帕病毒和丝状病毒，我们预测，靶向之间的相互作用结构域 丝状病毒VP 40和宿主Tsg 101和Nedd 4将作为开发新的和强大的广谱抗病毒药物的基础。 广谱抗病毒药物。 我们的高度互动和专家合作者团队将在我们的承诺基础上再接再厉 在对480万种化合物进行计算机筛选后获得的初步结果， 候选的小分子抑制丝状病毒HIV-Tsg 101（Aim 1）和丝状病毒HIV-Nedd 4（Aim 2）的相互作用 R21是该项目的一部分。在本提案的R33阶段，我们将开发和利用荧光 终身成像显微镜（FLIM），用于在功能上/机制上对抑制剂进行分类，因为它们破坏了病毒的传播 宿主蛋白质相互作用的真实的时间，并评估其作用模式，从而奠定了基础， 开发和测试多种药物疗法（目标3）。 最后，我们将确定抑制剂的疗效， 使用已经产生的WT和突变型VP 40 L β结构域VSV重组体进行的临床前活病毒研究（BSL研究） 2设置）。 此外，与G博士合作。 Olinger（USAMRIID），我们将测试成熟的领先候选人 抑制剂在BSL 104环境中阻断活病毒、EBOV和MARV流出的能力（Aim 4）。

The filoviruses (Ebola and Marburg) cause severe hemorrhagic fever syndromes with high mortality rates. As  these  RNA  viruses  are  classified  as  NIAID  Category  A  pathogens,  the  current  lack  of  effective  vaccines  and  antiviral  therapeutics  for  these  deadly  pathogens  is  particularly  concerning.  We  and  others  have  established  that efficient filovirus budding is critically dependent on the subversion of host proteins Tsg101 and Nedd4 and  that  viral  PTAP  and  PPxY  late  (L)  budding  domains  are  critical  for  these  interactions,  respectively.  As  disruption  of  virus  budding  would  prevent  virus  dissemination,  we  propose  to  directly  evaluate  the  ability  of  small  molecule  inhibitors  to  disrupt  Tsg101­PTAP  and  Nedd4­PPxY  interactions,  thereby  preventing  virus  budding.  Our  collaborators,  Drs.  Michael  Lee  and  Mark  Olson  (USAMRIID,  Ft.  Detrick,  MD),  have  used  the  known  structures  of  Tsg101­PTAP  and  Nedd4­PPxY  interactions  to  guide  the  in  silico  selection/design  of  competitive interaction blockers. We are currently evaluating the ability of top candidate inhibitors to disrupt the  host­dependent  egress  of  virus  particles  in  virus­like  particle  (VLP)  budding  assays.  As  Tsg101­PTAP  and  Nedd4­PPxY interactions are too weak and/or transient to be detected by standard biochemical approaches,  our laboratory has successfully developed a powerful bimolecular complementation (BiMC) approach to detect  these viral­host interactions in live cells. We will use this innovative technique to determine whether candidate  inhibitors  disrupt  these  virus­host  interactions.  Promising  preliminary  results  with  one  lead  compound  (5539­ 0062) support the feasibility of this proposal. As L­domain containing matrix proteins are required for efficient  virus­cell  separation  of  many  RNA  viruses,  including  retroviruses,  arenaviruses,  rhabdoviruses,  paramyxoviruses, henipaviruses, and filoviruses, we predict that targeting the interaction domain between  filovirus VP40 and host Tsg101 and Nedd4 will serve as basis for the development of new and powerful broad­ spectrum antiviral drugs.  Our group of highly interactive and expert collaborators will build upon our promising  preliminary  results  obtained  following  an  in  silico  screen  of  4.8  million  compounds  to  functionally  validate  candidate small molecules that inhibit filovirus­Tsg101 (Aim 1) and filovirus­Nedd4 (Aim 2) interactions during  the R21 phase of this proposal. In the R33 phase of this proposal, we will develop and utilize Fluorescence  Lifetime  Imaging  Microscopy  (FLIM)  to  functionally/mechanistically  categorize  inhibitors  as  they  disrupt  virus­ host  protein  interactions  in  real  time  and  assess  their  mode  of  action,  thereby  laying  the  foundation  for  development and testing of multi­drug therapies (Aim 3).  Lastly, we will determine the efficacy of inhibitors in  preclinical live virus studies using WT and mutant VP40 L­domain VSV recombinants already generated (BSL­ 2  setting).  Moreover,  in  collaboration  with  Dr.  G.  Olinger  (USAMRIID),  we  will  test  mature  lead  candidate  inhibitors for their ability to block egress of live, EBOV and MARV in a BSL­4 setting (Aim 4).