Host-Oriented Therapeutics Targeting Filovirus Budding.

点击翻译按钮获取中文摘要

The filoviruses (Ebola and Marburg) cause severe hemorrhagic fever syndromes with high mortality rates. As  these  RNA  viruses  are  classified  as  NIAID  Category  A  pathogens,  the  current  lack  of  effective  vaccines  and  antiviral  therapeutics  for  these  deadly  pathogens  is  particularly  concerning.  We  and  others  have  established  that efficient filovirus budding is critically dependent on the subversion of host proteins Tsg101 and Nedd4 and  that  viral  PTAP  and  PPxY  late  (L)  budding  domains  are  critical  for  these  interactions,  respectively.  As  disruption  of  virus  budding  would  prevent  virus  dissemination,  we  propose  to  directly  evaluate  the  ability  of  small  molecule  inhibitors  to  disrupt  Tsg101­PTAP  and  Nedd4­PPxY  interactions,  thereby  preventing  virus  budding.  Our  collaborators,  Drs.  Michael  Lee  and  Mark  Olson  (USAMRIID,  Ft.  Detrick,  MD),  have  used  the  known  structures  of  Tsg101­PTAP  and  Nedd4­PPxY  interactions  to  guide  the  in  silico  selection/design  of  competitive interaction blockers. We are currently evaluating the ability of top candidate inhibitors to disrupt the  host­dependent  egress  of  virus  particles  in  virus­like  particle  (VLP)  budding  assays.  As  Tsg101­PTAP  and  Nedd4­PPxY interactions are too weak and/or transient to be detected by standard biochemical approaches,  our laboratory has successfully developed a powerful bimolecular complementation (BiMC) approach to detect  these viral­host interactions in live cells. We will use this innovative technique to determine whether candidate  inhibitors  disrupt  these  virus­host  interactions.  Promising  preliminary  results  with  one  lead  compound  (5539­ 0062) support the feasibility of this proposal. As L­domain containing matrix proteins are required for efficient  virus­cell  separation  of  many  RNA  viruses,  including  retroviruses,  arenaviruses,  rhabdoviruses,  paramyxoviruses, henipaviruses, and filoviruses, we predict that targeting the interaction domain between  filovirus VP40 and host Tsg101 and Nedd4 will serve as basis for the development of new and powerful broad­ spectrum antiviral drugs.  Our group of highly interactive and expert collaborators will build upon our promising  preliminary  results  obtained  following  an  in  silico  screen  of  4.8  million  compounds  to  functionally  validate  candidate small molecules that inhibit filovirus­Tsg101 (Aim 1) and filovirus­Nedd4 (Aim 2) interactions during  the R21 phase of this proposal. In the R33 phase of this proposal, we will develop and utilize Fluorescence  Lifetime  Imaging  Microscopy  (FLIM)  to  functionally/mechanistically  categorize  inhibitors  as  they  disrupt  virus­ host  protein  interactions  in  real  time  and  assess  their  mode  of  action,  thereby  laying  the  foundation  for  development and testing of multi­drug therapies (Aim 3).  Lastly, we will determine the efficacy of inhibitors in  preclinical live virus studies using WT and mutant VP40 L­domain VSV recombinants already generated (BSL­ 2  setting).  Moreover,  in  collaboration  with  Dr.  G.  Olinger  (USAMRIID),  we  will  test  mature  lead  candidate  inhibitors for their ability to block egress of live, EBOV and MARV in a BSL­4 setting (Aim 4).